响应面法优化蛹虫草蛋白超声波辅助提取工艺及其营养评价

侯若琳 刘鑫 项凯凯 陈磊 郑明锋 傅俊生

（1. 福建农林大学食品科学学院，福州 350002；2. 福建农林大学生命科学学院，福州 350002）

蛹虫草（Cordyceps militarisL. Link），又名北冬虫夏草、北虫草等，属于子囊菌门、核菌纲、麦角菌科、虫草属［1］，它是一种珍贵的食药用真菌，具有重要的经济价值［2］。研究表明蛹虫草含有许多活性成分，如虫草素、多糖、虫草酸、麦角甾醇、甘露醇和蛋白质［3-7］等。目前蛹虫草相关产品开发主要集中在利用虫草素、腺苷、多糖等活性成分，而对于其蛋白质的提取性研究报道及市场上针对蛹虫草蛋白进行研究开发的产品却并不多见。蛋白质作为蛹虫草的主要成分之一，约占虫草干重的30%，研究证实它具有许多生物学活性，Qing等［8］研究表明蛹虫草蛋白可以抑制小鼠4T1肿瘤细胞转移；Liu等［9］研究发现蛹虫草蛋白中的纤溶酶可以预防血栓的形成。随着蛹虫草蛋白研究不断的深入，诸多的生物活性将逐渐被揭示，用途也将日益广泛，加强蛹虫草蛋白提取方法研究对于蛹虫草蛋白的进一步开发利用具有重要经济价值。

常规的蛋白质碱法提取工艺提取时间长、提取温度高、提取效率低、容易导致蛋白质变性等缺点，而超声波辅助提取法具有提取时间短、提取效率高、环境污染小和成本低等优点，但超声时间过长、温度过高会破坏蛋白质的空间结构，使蛋白活性丧失［10-13］。为避免超声时间过长而破坏蛹虫草蛋白的活性，本实验首先将蛹虫草子实体粉末超声一段时间，使蛹虫草细胞壁破碎后，停止超声，继续搅拌提取，使蛋白进一步溶出，提高蛋白提取效率，并进一步对所提取蛋白的氨基酸组成与营养价值进行了分析，为蛹虫草蛋白营养保健食品的开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蛹虫草子实体 购于福建省古田县；BCA蛋白浓度测定试剂盒：上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备 KH3200B型超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；85-1型恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；ST 20型pH计：美国奥豪斯公司；K 9840型凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；ST16R型离心机：美国Thermo公司；Agilent1100液相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 总蛋白含量测定 参照中华人民共和国国家标准GB 5009.5-2016《食品安全国家标准测定-食品中蛋白质的测定》中第一法进行测定分析［14］，经过测定虫草子实体的蛋白含量为28.88 g/100 g。

1.2.2 提取蛋白含量测定 采用BCA法测定，取20μL一定浓度梯度的蛋白标准品加入到微孔板中，再加入180 μL的BCA工作液，充分混匀后置于37℃孵育30 min，冷却到室温，在562 nm处检测吸光度，绘制标准曲线。根据上述同样方法测定蛋白提取液吸光度，依据标准曲线计算提取液中蛋白浓度。

1.2.3 蛹虫草蛋白的提取 精确称取干燥蛹虫草子实体粉末1.00 g溶于不同pH和料液比的缓冲溶液中→25℃超声提取→关闭超声后继续搅拌提取（以上具体方法细节见1.2.4）→6 000 r/min 离心10 min→用BCA法检测上清液蛋白的含量→上清液调节至虫草蛋白的等电点（pH=4）→7 000 r/min离心10min→弃上清，沉淀用去离子水复溶→调节pH至中性→冷冻干燥得到蛹虫草蛋白粉。

1.2.4 单因素实验 分别考察超声时间、pH、料液比、搅拌提取温度和搅拌提取时间对虫草蛋白提取率的影响，以蛋白提取率为指标（表1）。

表1 单因素试验因素与水平

1.2.5 响应面因素的确定 依据单因素实验结果，采用Desig-expert 8.0.6软件，根据Box-Behnken中心组合原理进行实验设计，优化超声波辅助提取蛹虫草蛋白工艺。

1.2.6 提取蛋白氨基酸组成与营养价值评价 参照于海燕等［15］的方法进行测定。样品前处理：称取0.2 g样品于密封瓶中，加入10 mL 6 mol/L HCl（含1%苯酚），充氮气1 min，封瓶，110℃水解22 h。取出冷却，定容至10 mL，90℃下氮吹挥干，0.01mol/L HCl溶解定容，过0.45 μm滤膜测定。检测条件：采用安捷伦公司自动在线柱前衍生化方法，一级氨基酸与邻苯二甲醛（OPA）、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯（FMOC）衍生后过柱检测。色谱条件：AAA-C18色谱柱（4.6×150 mm，3.5 μL）；检测信号：紫外338 nm，荧光（EX=266 nm，EM=305 nm）；流动相A：40 mmol/L磷酸二氢钠（pH7.8）；流动相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10，采用梯度洗脱方式（表2）。采用氨基酸评分（AAS）来评价蛋白质氨基酸的营养价值。

表2 HPLC洗脱条件

1.2.7 统计学处理 采用SPSS 13.0和Desig-expert 8.0.6软件进行数据统计学处理和分析。采用t检验分析两组之间的差异。P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 蛹虫草蛋白提取单因素试验

2.1.1 超声时间对蛹虫草蛋白提取率的影响 在pH8.5、料液比1∶40、搅拌提取温度25℃、搅拌提取时间2 h的条件下，超声时间分别为10 min、20min、30 min、40 min，研究超声时间对蛋白提取率的影响。超声时间越长，有利于细胞壁的破碎和蛋白的溶出，但超过30 min时，蛋白提取率基本不变，因此选取超声30 min为超声辅助提取蛹虫草蛋白的最佳超声时间（图1-A）。

2.1.2 搅拌提取温度对蛹虫草蛋白提取率的影响 在pH8.5、料液比1∶40、超声30 min、搅拌提取时间2 h的条件下，搅拌提取温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃，研究提取搅拌温度对蛋白提取率的影响。蛹虫草蛋白提取率随着搅拌提取温度的升高呈增加趋势，当温度提升至35℃后，提取率变化不大；提取温度过高，可能会导致蛋白的活性下降，同时加大能源的消耗，因此选取35℃为超声辅助提取蛹虫草蛋白的最佳搅拌提取温度（图1-B）。

2.1.3 搅拌提取时间对蛹虫草蛋白提取率的影响 在pH8.5、料液比1∶40、超声时间30 min、提取温度35℃的条件下，搅拌提取时间分别为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，研究搅拌提取时间对蛋白提取率的影响。当搅拌提取时间超过1 h时，提取率随时间延长而降低（图1-C），这可能是由于提取时间过长，导致蛋白结构发生变化，可溶性蛋白含量下降，同时也会加大能源的消耗，所以本实验在搅拌提取时间为1 h的条件下进行蛋白提取较为适宜。

2.1.4 pH对蛹虫草蛋白提取率的影响 在料液比1∶40、超声时间30 min、提取温度35℃、搅拌提取时间1 h的条件下，pH分别为6.5、7.5、8.5、9.5，研究pH对蛋白提取率的影响。提取率随着pH的增加先升高后降低，并且pH过高会导致蛋白质变性和水解，活性降低（图1-D），所以本实验在pH为8.5的条件下进行蛋白提取较为适宜。

2.1.5 料液比对蛹虫草蛋白提取率的影响 在pH8.5、超声时间30 min、搅拌提取温度35℃、搅拌提取时间1 h的条件下，料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，研究料液比对蛋白提取率的影响。蛹虫草蛋白质提取率随着料液比的升高成增加趋势，但超过1∶40时，增加缓慢（图1-E）；考虑到料液比过大会造成溶剂浪费并且不利于后处理，所以本实验在料液比为1∶40的条件下进行蛋白提取较为适宜。

2.2 响应面试验设计及结果

根据单因素实验结果，超声时间为30 min，搅拌提取温度为35℃对蛹虫草蛋白的提取最佳，从提取率出发，选定超声时间为30 min，搅拌提取温度为35℃的前提下，采用Box-Behnken 中心组合试验设计，以A（pH）、B（料液比）和C（搅拌提取时间）为自变量，以蛋白提取率（Y）为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验（表3）。

图1 各单因素对蛹虫草蛋白质提取率的影响

表3 Box-Behnken试验因素与水平

通过Desig-expert 8.0.6数据处理软件对表4所列结果进行分析，得到A（pH）、B（料液比）、C（搅拌提取时间）3个因素与Y之间的回归方程：Y=82.87 +3.09 A + 2.28 B +0.84C-15.59A2+ 1.04B2-2.00C2-1.00 AB-0.18AC-0.69 BC；对回归模型进行方差分析，该模型的p＜0.0001，说明该模型具有高度的显著性；失拟项P=0.272 2，失拟不显著，说明回归方程的拟合程度较好；模型的相关系数R2=0.997 8，表明模型实际值与预测值拟合较好，可解释蛋白提取率响应值的变化，可利用该回归方程较好的分析和与预测最佳提取条件。

2.3 响应面优化及模型验证

通过对上述试验结果的分析，可以预测最优提取条件及提取率，由回归系数的显著性检验可知（表5），模型的一次项A、B影响极显著（P≤0.01），C影响显著（P≤0.05），二次项A2、C2影响极显著（P≤0.01），B2影响显著（P≤0.05），交互项AB影响显著（P≤0.05）；根据一次项系数的绝对值可知，各因素对蛹虫草蛋白提取率的影响主次顺序为pH＞料液比＞搅拌提取时间。根据回归分析结果绘制响应曲面，以确定pH、料液比、搅拌提取时间对蛋白提取率的影响（图2）。对回归方程进行求导，可求得极值点，即A=0.067，B=1.0，C=0.034，用Desigexpert 8.0.6软件进行数学模型预测，最优反应条件为：pH8.57、料液比1∶50、搅拌提取时间72 min，在最优提取条件下，蛋白提取率可达86.26%。

表4 响应面试验设计及试验结果

为进一步验证模型预测的准确性，采用优化后的工艺参数（pH8.57、料液比1∶50、反应时间72 min）进行验证试验，在此条件下重复3次实验，3次实验提取率的平均值为85.6%，与理论预测值的相对误差在± 0.77%内，由此可知，模型预测值和实际值之间有较好的拟合性，能够较好的反映不同条件下蛋白提取率的变化。

表5 回归模型的方差分析及显著性检验

2.4 超声波辅助取组与不超声组对比

为了验证超声波对蛹虫草蛋白提取的促进作用，实验设置了一组不超声的对照。结果（表6）表明超声波辅助提取比不超声的对照组的蛋白质提取率提高了34.75%，这是因为超声波可以产生强烈振动、空化效应和搅拌作用来破坏细胞壁，使细胞内的蛋白更易溶出。

表6 超声波辅助提取与不超声对照组提取率对比

图2 响应面法立体分析图

2.5 提取蛋白氨基酸组成及营养价值评价

超声波辅助提取法所提取的蛹虫草蛋白含有17种氨基酸（色氨酸未测），含有7种人体必需氨基酸，必需氨基酸占总氨基酸的比值EAA /TAA为44.4%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值EAA /NEAA为79.84，均大FAO/WHO的推荐值40%和60%；除赖氨酸、蛋氨酸+胱氨酸低于世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和粮农组织（The Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）标准模式，其余必需氨基酸均与WHO/FAO标准模式相当（表7），表明蛹虫草蛋白质具有较高的营养价值。

表7 提取蛹虫草蛋白氨基酸成分及营养价值评价

3 讨论

响应面法是一组用于探索和优化过程参数的数学统计方法。它使用一个简单的方程来定义测试变量如何影响结果，并探索变量之间的相互关系。本实验将超声波辅助提取技术和响应面法相结合来优化蛹虫草蛋白提取工艺参数，得到了最佳提取工艺参数，并且采用超声波辅助提取方法比不超声的对照组的蛋白质提取率提高了34.75%，表明该方法是一种有效的蛹虫草蛋白提取方式。

实验进一步对最优条件下所提蛹虫草蛋白氨基酸组成与营养价值进行了分析。研究结果显示所提取的蛹虫草蛋白含有丰富的氨基酸，其中谷氨酸含量最高（10.35%），其次是天门冬氨酸（9.20%）。谷氨酸在人体内可促进氮基丁酸的合成，从而降低血氨，促进脑细胞呼吸，可以用于治疗神经精神疾病，如精神分裂症和脑血管障碍等引起的记忆和语言障碍、小儿智力不全等。天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，可用于治疗心脏病、肝脏病、高血压症，具有防止和恢复疲劳的作用［17］。蛹虫草蛋白必需氨基酸占总氨基酸的比值EAA/TAA为44.4%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值EAA /NEAA为79.84%，均大FAO/WHO的推荐值40%和60%，表明所提蛹虫草蛋白质具有较高的营养价值，该研究为蛹虫草蛋白营养保健食品的开发奠定了基础。

4 结论

蛹虫草蛋白超声波辅助提取的最优条件为：料液比1∶50、pH=8.57，150 W功率下超声30 min，然后关闭超声波，置于35℃条件下继续搅拌提取72 min，此条件下蛋白质提取率达到85.6%，是不超声对照组蛋白提取率的1.68倍，与模型预测值相对误差为±0.77%。所提取的蛹虫草蛋白含必需氨基酸占总氨基酸的比值为44.4%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为79.84%，均大于世界粮食与农业组织和世界卫生组织的推荐值。