结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2阻遏调控rv1057基因转录的研究

付加芳 张佩佩 宗工理 王新圆 刘萌 曹广祥

（1. 山东省医药生物技术研究中心，济南 250062；2. 山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南250100）

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是肺结核病的病原菌，携带人口数约占全世界总人口的1/4，结核分枝杆菌多重耐药性菌株的发病率已经接近10%［1］，因此结核病的预防和治疗面临严峻挑战。研究表明，结核分枝杆菌的致病性与其分泌蛋白有关，分泌蛋白参与了病原菌与宿主之间的相互作用，在结核分枝杆菌侵入、潜伏和致病等方面扮演着重要的角色。Type VII分泌系统是在结核分枝杆菌中发现的分泌系统，包括ESX-1、ESX-2、ESX-3、ESX-4和ESX-5等，负责一些与致病性有关的蛋白质分泌［2］。例如，ESX-1系统负责分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，ESAT-6是在感染早期分泌的主要抗原蛋白，能够抑制巨噬细胞的自噬功能，帮助结核分枝杆菌从溶酶体逃逸到细胞质，诱导巨噬细胞的凋亡［3-6］；而ESX-5系统负责分泌PE和PPE大分子蛋白，PE和PPE与细菌免疫原性有关，参与了修饰巨噬细胞成熟化、诱导促炎症因子IL-1β表达和诱导巨噬细胞死亡等过程［7-8］。

结核分枝杆菌有一层由分枝菌酸组成的外膜，在细菌表面形成通透性屏障阻碍蛋白质的分泌，现在还不清楚其外膜运输机制，例如ESX-1的外膜运输通道［9］。Rv1057是结核分枝杆菌中唯一的7-折叠片β-螺旋蛋白，β-螺旋蛋白具有典型的筒状蛋白质结构特征，生物功能包括转运蛋白、结构蛋白、信号蛋白和细胞膜蛋白等［10］。结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生长早期大量合成Rv1057，而生长后期几乎检测不到Rv1057［11］。此外，敲除rv1057基因会显著降低ESAT-6的分泌［12］，说明Rv1057可能参与了结核分枝杆菌的早期感染过程。

rv1057基因存在复杂的转录调控，其上游基因间隔区域具有1 003个碱基。前期研究显示rv1057基因受到双组份信号转导系统（Two-component regulatory system，TCS）MprAB和 TrcRS的 调 控，应答调控蛋白TrcR可以结合rv1057启动子区域中富含AT碱基的序列［11］，MprA在rv1057启动子区域有多个结合位点［13］。MprA是激活rv1057转录的调控因子，TrcR则是阻遏rv1057转录的调控因子［14］。

原核生物染色体形成直径仅数微米的拟核结构，由一系列拟核结合蛋白（Nucleoid-associated proteins，NAPs）维持，Lsr2是革兰氏阳性菌中第一个被发现的拟核结合蛋白［15］，在低氧、营养缺乏等压力条件下，lsr2基因表达明显上调，并通过与DNA结合形成物理屏障，协助细菌对抗损伤［16］。研究发现Lsr2在结核分枝杆菌基因组上有数百个结合位点，说明Lsr2能发挥全局性调控作用［17］。我们预测Lsr2可能是rv1057基因转录的一个阻遏蛋白，本研究通过凝胶阻滞迁移试验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）分析和转录水平分析解析了Lsr2对rv1057基因的调控方式，研究结果可为阐明Rv1057的生物学功能提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 结核分枝杆菌野生型菌株H37Rv为本实验室保存，△lsr2突变菌株为Voskuil MI馈赠［16］。大肠杆菌 DH5α和 BL21（DE3）购自碧云天生物技术公司。pEASY-Blunt载体购自全式金生物技术公司。携带无启动子lacZ报告基因的pSM128载体和表达载体pET15b为本实验室保存。

1.1.2 实验试剂 7H9、7H10、OADC、胰蛋白胨、酵母提取物购自美国Difco公司，［γ-32P］ATP 购自美国PerkinElmer公司，T4 Polynucleotide Kinase购自美国Promega公司，Silica/Ceramic Beads购自美国MP公司，M-MLV购自Thermo公司，SYBR Premix EX Taq购自大连宝生物。

1.2 方法

1.2.1 重组Lsr2蛋白和TrcR蛋白的表达与纯化 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，用PCR扩增Lsr2蛋白的编码基因，连接到pEASY-Blunt组成pBlunt-Lsr2，并进行DNA测序验证。测序正确后用NdeI和XhoI进行酶切，切下的片段连接到pET15b质粒构建重组表达载体pET15b-Lsr2。然后将pET15b-Lsr2转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导和Ni-NTA 柱（Sangon）纯化获得重组Lsr2蛋白，纯化的重组Lsr2蛋白经SDS-PAGE分析和浓度检测后备用。TrcR蛋白用已报道的方法进行制备［14］。Lsr2编码基因的PCR扩增引物为：Lsr2-15b-F：CATATGGCGAAGAAAGTAACCGTCACCT和 Lsr2-15b-R：CTCAGATCAGGTCGCCGCGTGGTATGCGTC。

1.2.2 EMSA分析Lsr2蛋白与rv1057启动子片段的结合情况 EMSA试验按照已报道的方法进行［14］。首先采用 Rv1057-ForN/Rv1057-RevN 引物PCR扩增含Lsr2结合位点的rv1057基因的255 bp（-503 - -249）启动子片段，并用［γ-32P］ATP和T4 Polynucleotide Kinase进行末端标记，然后与适量Lsr2蛋白溶液温育，8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最后用X-胶片曝光。

采用同样的方法分析Lsr2蛋白、TrcR蛋白与带突变位点启动子序列的结合情况，带突变位点的81 bp启动子序列采用化学合成获得。rv1057基因启动子片段的PCR扩增引物为Rv1057-ForN：TGACCACTAACCAGTCTCATCG，Rv1057-RevN：GGTATGTGGCAAACCAGTGCTA。

1.2.3 启动子-lacZ报告基因菌株构建和lacZ基因转录水平分析 报告基因菌株构建按照已报道的方法进行［12］。采用重叠PCR扩增不同区域和带突变位点的rv1057启动子片段，连接到中间载体并测序验证，然后连接到pSM128载体上，构建启动子-lacZ融合载体。重组质粒和pSM128空质粒通过Gene PulserXcell（BioRad）电击转化分别转入H37Rv菌株，用50 μg/mL链霉素筛选转化子并用PCR进行验证。

将导入不同重组pSM128质粒的H37Rv菌株培养至对数生长期，然后接入新鲜7H9/OADC培养基中并加入0.05%十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS），分别在第24 h，48 h和120 h收集菌体，提取总RNA，反转录成cDNA，并用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）分析基因转录水平，试验重复3次。用不加模板的样品作为阴性对照，并用看家基因16S rRNA作为内标校正因样品初始浓度不同而造成的差异。

lacZ融合载体构建的PCR扩增引物：Rv1057-fusFor1：TGATCACTAGTGCTTGGTTTGTTCGCCG，Rv1057-fusRev1：TGATCAGCGCCGCTCCTCCTCATCA。lacZ基因上游：CCTGAGGCCGATACTGTCGT，下 游：TTGGTGTAGATGGGCGCAT；16S rRNA基因上游：TCCCGG GCCTTGTACACA，下游：CCACT-GGCTTCGGGTGTTA。

1.2.4 △lsr2突变菌株中Rv1057蛋白表达分析 将H37Rv和△lsr2突变菌株培养到对数生长期，转接到新鲜7H9/OADC培养基中并加入0.05% SDS，并在37℃水平摇床上晃动培养，分别在第24 h，第48h和120 h离心收集菌体。提取总RNA，反转录成cDNA，并用qRT-PCR分析lsr2基因转录水平。用不加模板的样品作为阴性对照，并用看家基因16S rRNA作为内标校正因样品初始浓度不同而造成的差异。同时用FastPrep（MP）振荡破碎菌体，离心收集上清，制备菌体蛋白。菌体蛋白按照以前的方法进行Western blot检测［14］，检测Rv1057蛋白表达量。

2 结果

2.1 Lsr2对rv1057启动子的结合分析

Lsr2是一个拟核结合蛋白，生物信息学分析发现rv1057启动子中有一个可能的Lsr2结合区域。

EMSA实验结果（图1-A）显示，重组Lsr2蛋白在体外条件下可以特异性地结合rv1057启动子片段，提高Lsr2蛋白用量时阻滞效应更加明显，而过量的非标记rv1057启动子片段能够将标记的rv1057启动子片段从Lsr2蛋白上竞争性解离下来，表明Lsr2可以结合rv1057的启动子。与此同时，TrcR也结合该启动子片段，而且同时加入Lsr2和TrcR蛋白产生2条阻滞条带（图1-B），说明Lsr2和TrcR都能够结合rv1057启动子。

我们进一步设计了可能含突变TrcR或Lsr2结合位点的启动子序列M1-M4（图1-E），结果（图1-C和1-D）显示Lsr2和TrcR结合野生型rv1057启动子片段和M1片段，仅Lsr2能结合而TrcR不结合M2片段，仅TrcR能结合而Lsr2不结合M4片段，Lsr2和TrcR都不能结合M3片段。

2.2 Lsr2和TrcR对rv1057启动子的调控分析

本研究构建了含有野生型和突变型rv1057启动子的pSM128重组载体，分析rv1057启动子上Lsr2结合位点对报告基因lacZ转录的影响。

qRT-PCR结果（图2）显示，包含完整rv1057启动子的P1 可以正常转录报告基因lacZ，但第120小时lacZ转录水受明显受到抑制，第24小时lacZ表达量为第120小时lacZ表达量的6.25倍，差异有统计学意义（t=27.84，P＜0.05）；缺失Lsr2结合位点的P1-M4启动子也能正常激活lacZ的转录，但第120小时lacZ转录水平显著高于野生型rv1057启动子，是野生型启动子的8.94倍，差异有统计学意义（t=13.54，P＜0.05）；缺失TrcR结合位点（P1-M2）时lacZ转录水平在第24小时明显升高，第120小时与野生型rv1057启动子无明显差异；而同时缺失Lsr2和TrcR结合位点（P1-M3）时，lacZ转录水在第24小时和第120小时都显著高于野生型rv1057启动子，差异有统计学意义（t值分别为8.61和20.23，P＜0.05）。

图1 Lsr2和TrcR结合rv1057启动子的EMSA分析

报告基因转录分析结果说明TrcR可能在感染早期发挥阻遏作用，而Lsr2可能在感染的中后期发挥阻遏作用。

图2 突变Lsr2位点对rv1057启动子的调控作用

2.3 Lsr2对rv1057表达的影响分析

为进一步研究在结核分枝杆菌内Lsr2对rv1057表达的影响，本研究采用qRT-PCR分析H37Rv和△lsr2突变菌株中trcR和lsr2转录水平的变化情况，并用Western blot分析Rv1057蛋白的表达情况。

qRT-PCR分析结果（图3-A）显示，培养24 h H37Rv菌株中lsr2转录水平较低，而第48小时和120 h的lsr2转录水平基本一致，分别是24 h的5.03倍和4.53倍，差异有统计学意义（t值分别为24.44、16.86，P＜0.05）；但是在H37Rv菌株中trcR转录水平的变化趋势与lsr2转录水平相反，第24小时的trcR转录水平是第48小时的4.86倍，是第120小时的10.03倍（图3-B），差异具有统计学意义（t值分别为6.79、10.16，P＜0.05）。△lsr2突变菌株中trcR转录变化趋势与H37Rv菌株基本一致（图3-B）。以上实验结果说明TrcR主要在结核分枝杆菌生长早期表达，而Lsr2在结核分枝杆菌生长中后期表达。

Western blot分析结果（图4），显示，H37Rv菌株中Rv1057在培养24 h和48 h的表达量较高，培养120 h Rv1057表达量非常少，而△lsr2突变菌株在培养120 h的Rv1057表达量较高，说明Lsr2在结核分枝杆菌生长中后期抑制Rv1057的表达，与qRT-PCR试验的分析结果一致。上述结果表明Lsr2是rv1057基因的负调控因子，在结核分枝杆菌生长的中后期阻遏rv1057基因的表达。

图3 lsr2和trcR转录水平的qRT-PCR分析

综合上述试验结果，本研究进一步完善了rvl057转录调控的模型：Lsr2和TrcR都是阻遏调控蛋白，MprA是激活调控蛋白；在结核分枝杆菌生长早期，TrcR结合rvl057启动子并阻碍rvl057的转录，当受到环境条件压力后MprA激活rvl057的转录并阻遏trcR表达，而随着时间的延长结核分枝杆菌开始表达Lsr2并阻碍rvl057的表达。

图4 H37Rv和△lsr2突变菌株中Rv1057蛋白的表达分析

3 讨论

Rv1057是一个7-折叠片β-螺旋蛋白，这类β-螺旋蛋白在细菌中具有功能多样性［10］。我们前期发现敲除rv1057基因影响结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活率［18］，以及 ESAT-6和 CFP-10的分泌［12］，说明rv1057可能影响结核分枝杆菌感染早期与巨噬细胞之间的应答，参与结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用。转录组测序分析显示在抑制细胞合成药物万古霉素的压力下rv1057转录水平上升［19］；Western blot检测显示在感染巨噬细胞的早期大量表达Rv1057，但感染后期检测不到Rv1057［11］；我们课题组前期研究则表明Rv1057在结核分枝杆菌受到细胞膜压力诱导（例如SDS或Triton X-100）的情况下被大量表达［13］，而且MprAB和TrcRS双组份信号转导系统同时参与rv1057的转录调控［13，18］，这些研究结果提示rv1057受到了非常精细和复杂的调控作用。

Lsr2是一个拟核结合蛋白，在革兰氏阳性菌中广泛存在［15］。染色质免疫共沉淀和基因表达芯片实验表明，Lsr2能够结合基因组的高AT含量区域并调控基因转录［17］。研究显示，TrcR和Lsr2都结合富含AT碱基的DNA序列，但是TrcR和Lsr2的结合位点不同，Lsr2的 DNA结合结构域能够特异性结合在高AT含量区域的DNA双螺旋结构小沟，沿DNA小沟方向伸展并覆盖约5个AT碱基序列［20］。rv1057启动子存在高AT含量区域，研究显示TrcR结合rv1057启动子的高AT区域，并且阻遏rv1057的转录［11］。本研究证实Lsr2也结合rv1057启动子的高AT区域，与TrcR均可阻遏rv1057的转录，但两者在不同的生长时期发挥阻遏作用。本研究发现H37Rv菌株中Rv1057在培养48 h的表达量较24 h的表达量有所升高（图4），暗示rv1057除了受到Lsr2和TrcR的调控，还受到其它调控因子（比如MprAB双组份信号转导系统）的调控，说明rv1057的表达受到非常精细和复杂的调控作用。

综上所述，本研究发现Lsr2结合rv1057启动子的高AT含量区域，和TrcR均可阻遏rv1057基因的表达。但TrcR在诱导条件下可以完全阻遏rv1057基因的表达，而Lsr2可能起到基础阻遏作用，不能完全封闭rv1057基因的表达。

4 结论

本研究通过凝胶阻滞迁移实验、荧光定量PCR实验和Western blot实验发现结核分枝杆菌拟核结合蛋白 Lsr2是rv1057基因转录的阻遏蛋白，并且与已知的阻遏蛋白TrcR均可调控rv1057基因的表达；Lsr2在结核分枝杆菌生长周期的中后期大量表达并阻遏rv1057的转录，TrcR则在结核分枝杆菌生长周期的早期阻遏rv1057的转录。