响应曲面法优化菠萝皮渣多糖的提取及其抗氧化活性研究

杭瑜瑜，秦紫琼，杨 波

（海南热带海洋学院生命科学与生态学院，海南三亚 572022）

0 引言

多糖具有调节免疫[1-2]、抗氧化[3-4]、抗突变[5]、抗肿瘤[6]、降血脂[7]、血糖[8]等多种生理活性，具有良好的应用前景。其提取方法有热水浸提法、酸提法、减提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法和酶解法等。热水浸提法不需特殊设备，成本低。菠萝生产过程中，大量菠萝皮渣是菠萝生产和加工的主要副产品，占全部水果质量的50%～60%[9]。相关研究表明，菠萝皮渣与菠萝果实中营养成分的种类与比例相差不多。在全球范围内，虽然一些研究是针对菠萝皮渣开发与利用的，但是研究成果应用的效果并不是很理想[10]。为了菠萝皮渣这一加工副产物可以被人们充分利用，试验以菠萝皮渣为原料提取菠萝皮渣中的多糖，并研究其抗氧化活性，可以提高菠萝皮渣废弃物的利用率，并增加植物多糖的来源途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料与试剂

菠萝皮渣：从市场收集新鲜菠萝皮渣，预处理后备用。

葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、邻苯三酚、浓盐酸等，均为分析纯。

1.1.2 主要试验仪器

ML-T型分析天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司产品；800型电动离心机，金坛市江南仪器厂产品；752N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；101-1AB型电热鼓风干燥箱，天津赛得利斯实验分析仪器厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菠萝皮渣中多糖的提取

选取新鲜的菠萝皮渣，用清水洗干净后，沥干水分。将其放入60℃干燥箱干燥12 h，并进行翻动，达到恒质量后将其粉碎，过60目筛，置于玻璃容器中密封保存，备用。称取适量菠萝皮渣，调整料液比1∶10，在温度50℃水浴下处理20 min，待提取液冷却后抽滤，以转速4 500 r/min对滤液离心10 min，上清液蒸发浓缩至原体积的1/4，加入4倍体积95%的乙醇溶液，于室温下醇沉12 h，以转速4 500 r/min沉淀离心20 min后取出，在50℃真空干燥箱干燥24 h，得到菠萝皮渣粗多糖，称质量。

1.2.2 菠萝皮渣多糖含量的测定方法

（1）菠萝皮渣多糖最大吸收波长确定。配制葡萄糖标准溶液，采用硫酸-苯酚法显色法使葡萄糖标准溶液显色，再使用紫外-可见分光光度计，于波长190～700 nm处进行光谱扫描，确定最大吸收波长。提取到的菠萝皮渣多糖也按相同的方法测定，确定最大吸收光谱。

（2） 葡萄糖标准溶液的配制及标准曲线绘制。精确称取葡萄糖标准品4 mg，溶解于烧杯之中，转移至50 mL容量瓶中，定容。逐步稀释后依次得到质量浓度为40.0，20.0，10.0，5.0，2.5 mg/L的葡萄糖溶液。各取2 mL溶液与比色管中，分别加入1 mL质量分数为6%的苯酚水溶液，迅速摇匀，接着立刻加入5 mL浓硫酸，溶液显色后放入冷水中冷却[11]，冷却后，使用分光光度计在最大吸收波长处依次测得不同质量浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，记录数据，并标准曲线。得到标准曲线方程为：Y=0.011 5X+0.078 3，R2=0.997 5。

（3）菠萝皮渣多糖含量的计算。将提取到的菠萝皮渣多糖溶解于烧杯中，转移至50 mL容量瓶中，定容后摇匀。按照1.2.2（2）中的显色方法，于最大吸收波长处测定菠萝皮渣多糖的吸光度。通过标准曲线公式进行计算，得到所提取的菠萝皮渣多糖的含量。

（4）菠萝皮渣多糖提取率的计算。

1.2.3 菠萝皮渣多糖提取的单因素试验

分别研究提取温度、料液比和提取时间对多糖提取率的影响。提取温度选取50，60，70，80，90℃；料液比选取 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；提取时间选取20，30，40，50，60 min。

1.2.4 菠萝皮渣多糖提取的响应曲面优化

依据单因素试验结果，设计响应曲面试验。

因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

1.2.5 菠萝皮渣多糖的体外抗氧化活性研究

（1）清除羟自由基活性的测定。参考杨江涛等人[12]的方法进行测定。

（2）清除超氧阴离子活性的测定。参考徐建国等人[13]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 菠萝皮渣多糖的吸收光谱图

按照1.2.2（1）的方法，葡萄糖标准品和菠萝皮渣多糖的光谱扫描图。

葡萄糖标准品的光谱扫描图见图1，菠萝皮渣多糖样品的光谱扫描图见图2。

从图中可以看出，葡萄糖标准品于波长489 nm处有最大吸收峰，菠萝皮渣多糖样品在相同的波长处有最大吸收。因此，所提取的样品为多糖。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 提取温度对菠萝皮渣多糖提取率的影响

在料液比1∶15，提取时间20 min的条件下，研究不同的提取温度对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

提取温度对菠萝皮渣多糖提取率的影响见图3。

由图1可知，当提取温度低于80℃时，随着提取温度的不断升高，多糖的提取率不断增大；当提取温度高于80℃后，随着提取温度的不断升高，多糖提取率开始呈下降趋势，因此选择提取温度80℃较为适宜。

2.麻雀虽小，五脏俱全，对联堪称微作文。要想写得像，必须按照对联特点去写，“拓展成上句，对应得下联”，是为入门法。要想写得好，必须是“有感而发，言简意赅，能耐人寻味。”因为，对联也是情感与智慧的结晶。

2.2.2 料液比对菠萝皮渣多糖提取率的影响

当提取温度80℃，提取时间20 min的条件下，研究不同料液比对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

料液比对菠萝皮渣多糖提取率的影响见图4。

由图4可知，随着浸提液料液比的增大，多糖的提取率先迅速升高，然后又呈现平缓增加趋势。提取液料液比增大，反应较完全，多糖的扩散速度增快，提取率有所升高；但提取液料液比过大，会给后续工艺增加难度，并且造成试剂浪费。因此，选择料液比1∶15较为合适。

2.2.3 提取时间对菠萝皮渣多糖提取率的影响

在提取温度80℃，料液比1∶15的条件下，研究不同的提取时间对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

提取时间对菠萝皮渣多糖提取率的影响见图5。

由图5可知，菠萝皮渣多糖提取率随着提取时间的延长不断提高，但在30 min之内增长迅速，30 min之后，提取率增长缓慢，变化较小，选择提取时间30 min较为合适。

2.3 响应曲面试验结果与分析

响应曲面试验设计与结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表2 响应曲面试验设计与结果

表3 回归模型方差分析

根据表3的方差分析结果可知，该模型显著程度极高（p＜0.000 1）。该模型的校正决定系数R2Adj=0.991 0，说明99.10%响应值的变化可以用该的模型来解释，仅仅大约1%不能用这个模型来解释。因此，用该模型分析热水浸提法对菠萝皮渣多糖的提取条件的优化研究是非常适宜的。3个单因素对菠萝皮渣中多糖提取率的影响程度依次为料液比＞提取温度＞提取时间。

根据数学回归模型得到的数据可以分析出，优化得到的提取菠萝皮渣多糖的最佳的提取工艺条件为提取温度86℃，料液比1∶20，提取时间20 min，在此条件下进行验证性试验，菠萝皮渣多糖的提取率为1.590 3%。

2.4 菠萝皮渣多糖的体外抗氧化活性测定结果

2.4.1 清除羟自由基活性的测定结果

当菠萝皮渣多糖质量浓度为9.1 mg/L时，其对羟自由基的清除作用达31.62%；当质量浓度达到18.21 mg/L时，其对羟自由基的清除作用达到36.75%。随着菠萝皮渣多糖质量浓度的逐渐增高，菠萝皮渣多糖对羟自由基的清除能力也逐渐增强，由此可以分析出二者之间具有一定的剂量效应关系[14]。

2.4.2 清除超氧阴离子活性的测定结果

当菠萝皮渣多糖的质量浓度为9.1 mg/L时，对超氧阴离子的清除作用达27.27%；当质量浓度达到36.42 mg/L时，对超氧阴离子的清除作用达到45.45%；当质量浓度达到72.83 mg/L时，菠萝皮渣多糖对超氧阴离子的清除作用可达到50%以上。超氧阴离子可以被菠萝皮渣多糖快速、有效地清除掉，其清除能力很强。并且其清除能力随着菠萝皮渣多糖质量浓度的升高而增强，由此可以分析出二者之间的剂量效应关系较好。

3 结论

热水浸提法提取菠萝皮渣中多糖的工艺条件为提取温度86℃，料液比1∶20，提取时间20 min，在此条件下进行验证性试验，多糖的提取率为1.590 3%。所提取的多糖具有较好的体外抗氧化活性。