免疫记忆与DNA疫苗

黄 丹，李乐山，杨文琳，孙汇苑

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

随着免疫学的不断发展，越来越多的免疫学理论与技术在各类临床疾病发病机制研究与预防治疗中得到应用。目前，免疫学研究中的一大热点研究是免疫记忆（Immunological memory）。免疫记忆是指免疫系统与抗原接触，产生对其初次的免疫应答，当免疫系统再次接触该抗原时，通常会产生再次免疫应答。这一种现象我们将其定义为免疫系统的记忆性。在免疫系统发生再次应答时会具有迅速、强烈、特异性高和持久的特点。虽然免疫记忆可以防止同一疾病的再次发生，但研究结果发现在某些特定的疾病中免疫记忆会对治疗效果或疾病恢复产生负面影响。因此，通过研究免疫记忆的特征，以及免疫记忆何时对人体具有积极作用、何时对人体具有消极作用，并合理利用免疫记忆对于现代医学和免疫学具有指导性意义。

1 免疫记忆的机制

免疫记忆分为B细胞免疫记忆和T细胞免疫记忆。二者分别在体液免疫和细胞免疫中产生作用。

对于体液免疫，当外界抗原初次入侵机体时，刺激成熟B细胞活化，从而增殖分裂成中心母细胞，伴随其表面受体BCR改变并与FDC滤泡性树突状细胞上的抗原结合，BCR亲和性高的B细胞发生阳性选择，大部分分化成为浆细胞，少部分成为记忆细胞，即长寿记忆B细胞和长寿浆细胞。再次接触抗原时，记忆B细胞快速大量增殖产生浆细胞。体液免疫的免疫记忆反应在抗体上表现为：第一次接触抗原产生应答时出现IgM，IgM增加到最大值时开始出现IgG。IgG出现时间晚但达到峰值后可以维持较长时间。初次免疫应答后形成记忆细胞，当机体再次接触抗原时便能在很短时间内大量产生IgG且水平更高。

对于细胞免疫，当外界抗原初次入侵机体时，刺激初始T细胞活化，活化后的T细胞变成效应T细胞和变成记忆T细胞。其中，效应T细胞中的辅助性T细胞帮助B细胞的活化，细胞毒性T细胞直接攻击靶细胞。记忆T细胞在再次接触抗原时快速大量增殖并转化为效应T细胞。记忆T细胞表面表达CD45RA-/CD45RO+，根据其分布位置的不同又分为两个亚群：中央型记忆T细胞（Tcm）和效应型记忆T细胞（Tem）。Tcm高表达CCR7与CD62L，而Tem低表达或者不表达CCR7与CD62L。两个亚群分布位置也不同，Tem存在于非淋巴组织，效应功能上的分化程度高，在再次接触抗原时能快速行使效应功能；Tcm高表达淋巴细胞归巢受体（淋巴细胞巢是指淋巴细胞的定向游动，依赖于淋巴细胞表面的归巢受体和内皮细胞上相应血管地址素的相互作用），能聚集于次级淋巴器官处，对凋亡的耐受性强，具有更强的生存能力和增殖潜能，在再次接触抗原时，能够快速增殖分化补充周围的效应T细胞。

2 免疫记忆的负面作用

虽然免疫记忆在预防同一疾病方面作用明显，但是这种机制也有负面作用。相关临床医学数据发现免疫记忆在肿瘤的发生、自身免疫疾病和器官移植上有明显的负面作用。

Byren KT等人利用免疫组化技术研究黑色素瘤时发现CD45RO+的记忆细胞亚群高表达具有免疫抑制性的白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β），抑制了效应细胞。同时肿瘤细胞封闭自身细胞膜上的抗原，使癌细胞更难以识别，加速了肿瘤转移。

Valujskikh A等人在器官移植手术中发现移植器官能否长期存活取决于对T细胞介导免疫排斥反应的耐受。器官移植一般都选择亲属中最匹配的人作为供体，但是研究发现记忆T细胞遇到同种抗原时会快速增殖分化为效应T细胞并侵入移植器官中以引起移植失败，所以，移植亲属的器官风险很大。临床上一般选择切除接受器官移植患者的胸腺或让患者服用抑制T细胞活性的药物，但这降低移植器官后患者对外界病原体的抵抗力。另外，在骨髓移植手术中，供体的免疫细胞在移植后易攻击宿主组织器官，引起植物抗宿主病（GVHD），这也是由记忆T细胞亚群所介导。CD45RC表达量高的CD4+记忆T细胞能够诱导GVHD的产生。但CD62L-的记忆T细胞能够抑制GVHD的产生，所以，通过医疗手段增加患者体内CD62L-的记忆T细胞，并减少CD45RC表达量高的CD4+记忆T细胞是消除骨髓移植排斥反应的好方法。

Beynon V等人在研究免疫记忆对于自身免疫疾病的影响中发现，正常情况下免疫系统对于自身的成分处于耐受状态，而一旦失调会产生相关免疫系统疾病。比如多发性硬化患者外周血液的CD8+Tcm含量明显增加，CD8+Tem含量明显减少，说明多发性硬化发生过程中可能存在记忆细胞亚群。CD8+的Tcm/Tem的比值明显增加也可能与多发性相关硬化免疫应答有关，比如相关研究发现在系统性红斑狼疮患者血液中记忆性CD8+T细胞含量减少而在尿液中含量增加，这是由于这些患者体内的记忆性CD8+T细胞大量从血液中转移至肾脏中并产生巨大伤害。综上所述，在治疗疾病时，需要考虑降低或者避免免疫记忆带来的负面作用。

3 DNA疫苗

DNA疫苗是在分子生物学技术基础上发展的第三代新型疫苗，现在已表现出相当大的应用潜力。相比于传统疫苗，DNA疫苗具有免疫效果好、造价低、临床应用方便等优点。由于提出时的有关技术还未满足需求，所以，DNA疫苗的安全性广受质疑。

随着基因工程技术的发展，目前，已能生产出风险低、效益高的DNA疫苗。DNA疫苗的本质是连接有病原体抗原基因的真核表达载体。类似传统疫苗的作用机理，DNA疫苗行使免疫功能也需要经过3步类似传统疫苗的作用过程：①抗原侵入。即将抗原物质注入机体，DNA疫苗往往依赖于载体被动进入机体细胞，在载体注入机体后被机体上皮细胞或肌细胞内吞摄入或直接被APC抗原呈递细胞吞噬。②抗原基因在受体细胞内表达。真核表达载体在设计过程中应考虑外源基因的表达问题，所以，DNA疫苗人工添加了强启动子和相关表达调控序列以增强表达能力，使其表达能够通过人工调控进行。当含有外源抗原基因的DNA疫苗被单核巨噬细胞吞噬后，抗原基因在强启动子作用下借助宿主细胞表达抗性蛋白，同时，细胞内部修饰抗性蛋白，形成特异性短肽。③抗原呈递和机体免疫系统的激活。合成的特异性抗原短肽可与MHC主要组织相容性复合体结合并暴露在APC细胞表面，通过与T细胞的双识别激活CD8+T细胞增殖，产生特异的CTL效应细胞。MHC类分子与Th细胞双识别，激活CD4+T细胞，Th细胞活化后增殖分泌大量可溶性细胞因子，刺激B细胞的增殖和分泌抗体以诱发体液和细胞免疫，并且产生免疫记忆。

4 DNA疫苗降低免疫记忆负面作用的机制

Cristillo等人在免疫试验中证明DNA疫苗可以诱导产生细胞免疫和体液免疫。相关人员利用含HIV病毒遗传物质的gp120质粒注射入恒河猴肌肉后，恒河猴体内产生了高效的中和性抗体，能够有效抵抗HIV病毒的攻击。这说明DNA疫苗发挥免疫应答作用的机制之一是诱发抗体反应。另外，他们发现在含有HIV遗传物质的gp120质粒处理后的恒河猴体内的辅助性T细胞因子和功能性CTL细胞能够维持长达1年时间的活性，这也证明了DNA疫苗还可以通过诱导机体产生细胞免疫而抵抗疾病。同时，功能性的CTL细胞可以识别与MHCⅠ类分子相连的约为9～11个氨基酸长度的抗原肽，由DNA免疫产生的外源蛋白抗原与MHCⅠ类分子结合后进入抗原提呈系统有助于CTL细胞识别这些抗原肽。

综上所述，免疫记忆对人体的负面作用大部分来自记忆性T细胞亚群数量的明显变化。魏海峰等人在利用CEA迷你肽表位基因疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫的研究中发现并构建了含有CEA625-667基因单倍体疫苗pcDNA-CEA625-667及三串联体DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667，将重组的DNA疫苗注入小鼠体内后，记录小鼠免疫系统内癌胚抗原和相关记忆细胞亚群的数量变化，比较对照组发现，小鼠体内的癌胚抗原和相关肿瘤促进因子含量也明显减少。免疫小鼠T细胞亚群检测结果中的两部分pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667和空质粒pcDNA3.0组免疫小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T细胞数和CD4+/CD8+值比较无明显差异，说明抑制免疫应答反应的部分记忆T细胞亚群数量并未发生增加。与全序列基因疫苗比较，迷你基因疫苗能够针对特异性抗原表位诱导免疫反应，避免无关抗原表位的影响。结果表明，迷你基因3倍体疫苗所引发的增殖效应以及释放细胞因子的水平均高于迷你基因单倍体，说明所采用的目的基因多倍串联的抗原改造方式增强了免疫效应，也降低了免疫记忆的负面作用。魏海峰等人得到结论CEA迷你肽表位基因单倍体及3倍体疫苗不仅明显改变动物体内CD4/CD8比值，有效降低免疫记忆促进癌细胞扩散的负面影响，还能诱导HTL活化，使被免疫机体T细胞趋向于Th1效应且3倍体疫苗的免疫原性强于单倍体疫苗。

5 结论

免疫记忆是一把双刃剑，它既能在防止同一疾病的再次发生上起到正面作用，又能在肿瘤发生、器官移植和自身免疫疾病方面起到负面作用。临床方面要注意对免疫记忆进行合理控制。DNA疫苗是第三代新型疫苗，可在一定水平上降低免疫记忆的负面作用，因此，可以指导医学免疫工作者在设计疫苗时根据不同的病原体引起的免疫应答设计诱导相应抗体或记忆细胞产生的疫苗，同时，控制记忆细胞中具有免疫抑制活性的亚群。

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