携MMP-2抗体的靶向造影剂对卵巢癌血管生成拟态超声评价的实验研究

刘 慧， 周 倩， 向 红， 秦伟芳

(1新疆医科大学第一附属医院妇产超声科， 乌鲁木齐 830054; 2河南科技大学第一附属医院超声诊断科， 河南 洛阳 471000)

卵巢恶性肿瘤病死率高，早期诊断仍是国内外学者需要研究突破的难题，而靶向超声造影有识别早期卵巢恶性肿瘤的应用前景[1]。肿瘤的发生与转移与其微环境密切相关，研究表明，血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是肿瘤微环境中营养肿瘤的另一运行模式，在肿瘤新生血管形成之前出现[2]。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2， MMP-2)与VM的形成密切相关并高表达[3-4]，另MMP-2是与卵巢癌恶性程度及转移因素相关的重要调节因子[5]。故本研究探讨以MMP-2为靶点的超声微泡对卵巢癌移植瘤在体评价的可行性，为临床提供以MMP-2为靶点的靶向造影剂(MBt)用于肿瘤的诊断及治疗研究提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1主要材料与仪器6～8周龄的10只BALB/cNude雌性裸鼠(SPF级)，体质量 18～22 g(北京维通利华生物科技有限公司),北京北纳创联生物技术研究院提供的人卵巢癌细胞株SKOV3,SonoVue(Bracco公司，意大利),罗丹明(TRITC)标记山羊抗大鼠IgG(H+L)(北京中杉金桥),一次性静脉输液针(规格0.45×15 RWLB，褐色，上海康德莱公司)，百胜My Lab 90彩色超声仪(LA522探头，频率 3～9 MHz),荧光显微镜。

1.2方法

1.2.1 裸鼠皮下移植瘤造模 SKOV3细胞株传代培养至7～8代，提取细胞，调整活细胞浓度为5×107个/mL，于每只裸鼠背部皮下接种0.2 mL，10只裸鼠背部皮下各接种1点，次日记为接种第1天，待瘤体长至21 d，肿瘤直径约5～10 mm时进行处理。

1.2.2 制备靶向造影剂[6]采用生物素-亲和素桥连接法制备携MMP-2单抗MBt，加入罗丹明标记山羊抗大鼠IgG，充分混匀后取混悬液10 μL涂片，在荧光显微镜下观察微泡与靶向抗体结合情况。

1.2.3 超声造影检查 10只裸鼠在接种21 d时，随机抽取并编号为1～10号，分别逐次进行普通造影剂(MBc)(MBc组)及MBt(MBt组)检查。首先，麻醉并保定动物，取俯卧位，经裸鼠尾静脉扎针并盐水留置待用。超声检查前在探头与移植瘤表面一次均匀涂抹较厚的耦合剂形成耦合剂层(避免耦合剂层内含空气气泡影响图像质量)；先对瘤体进行常规超声检查，观察其形态学指标(即大小、形态、内部回声与基底部界限)，采用彩色多普勒超声观察瘤体血流供应情况，选取瘤体内血流信号最丰富区域为感兴趣区；分别在每只裸鼠的尾静脉注射0.2 mL MBc，观察造影剂进入瘤体及完全消退的全过程；至少经2 h后，待瘤体内MBc清除干净，再次在鼠尾静脉留置管内注射0.2 mL MBt (约1.9×107个微泡数)观察造影全过程，造影的全程动态影像资料均即刻同步记录并保存备后期分析。对MBc及MBt组造影后瘤体内造影剂显像的声像图特征进行分析。使用Qontrast超声造影软件分析造影相关参数：峰值强度(peak intensity,PI)、持续时间(time to duration,TTD)、达峰时间(time to peak，TTP)及平均通过时间(mean transit time，MTT)。

1.2.4 病理学分析 造影结束后，裸鼠被立即处死，完整取出瘤体，先固定(经4%甲醛溶液)，后石蜡标本常规切片。 采用CD31/PAS双重染色法测定血管生成拟态(VM)，先在低倍镜(×100)下找出VM的典型区域后在高倍镜(×400)下计数，取10个视野中VM数的平均值计算。免疫组织化学法测定离体标本中MMP-2抗原的表达：分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分，采用的是半定量结果判断。染色强度判断：棕褐色、棕黄色、淡黄色、无色分别记为3、2、1、0分。阳性细胞数为76%～100%、 51%～75%、 26%～50%、5%～25%、<5%时分别记为4、3、2、1、0分。两者计分相乘即为阳性等级：9～12分、5～8分、1～4分、0分记为强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)、阴性(-)。阳性细胞计数：在低倍镜(×100)下，浅黄、黄、棕黄、棕褐色出现在肿瘤细胞胞质或胞核为染色阳性视野。选10个视野，计数每100个细胞中的阳性细胞数为阳性率(高倍镜×400)，至少计数1 000个细胞。

1.3统计学处理采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，以中位数M(P25，P75)表示不符合正态分布的计量资料，MBc及MBt组TIC曲线参数比较采用Mann-Whitney U 检验，两变量资料相关分析用Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤的情况10只裸鼠均无死亡，在接种第10天，6只裸鼠背臀部可见有米粒样凸起，第21天，10只裸鼠的背臀部均可见长径5～10 mm的实性肿块隆起，长径平均为6.6 mm，肿块表面光滑，未见明显破溃。

2.2携MMP-2的MBt制备情况光学显微镜下微泡数为9.5×107个/mL，荧光显微镜下微泡数为8.7×107个/mL。应用流式细胞仪检测携MMP-2抗体与微泡的结合率达88.9%，且结合稳定，在荧光显微镜下，橙红色荧光由微泡表面发出。

2.3MBt与MBc灌注特征及时间强度曲线参数的比较二维超声显示肿瘤内部均呈低回声，CDFI示其内部见星点状或无明显血流信号，周边可见条状血流信号。MBt与MBc造影可见造影剂由肿瘤基底部快速向肿瘤周边，之后向中央灌注，直至整个瘤体完全被造影剂充填，造影剂消退时首先是中央区消退，然后至周边逐渐消退，直至完全消退。造影剂灌注时，部分MBt组造影灌注强度较MBc组强；造影剂消退时，MBt组周边组织与瘤体间分界较MBc组明显清晰(图1)。相比MBc组，MBt组的达峰时间提前，持续时间、平均通过时间均延长，差异有统计学意义(P<0.05)；2组间峰值强度差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

a： MBc 26 s达灌注高峰 b： MBc消退时移植瘤边界不清(箭头示)

c： MBt 9 s达灌注高峰 d： MBt消退时边界清晰(箭头示)

注：Mann-Whitney U 检验，峰值强度(PI)、持续时间(TTD)、达峰时间(TTP)及平均通过时间(MTT)

2.4MMP-2与VM显示及其相关性离体标本内显示VM结构(图2)，表现为内皮标记物CD31染色阴性,PAS染色阳性(即CD31/PAS双重染色法)且由肿瘤细胞围成的梭形或管状结构。MMP-2在卵巢癌移植瘤内大量表达为棕褐色颗粒,并且在肿瘤细胞围成的管状结构中也存在大量棕褐色颗粒(图2)。造影TTD与MMP-2抗原、VM数量呈正相关(r=0.72、0.78，P<0.05)。MMP-2抗原与VM数量呈正相关(r=0.88，P<0.05)(图3)。

3 讨论

表面结合特异性抗体的靶向超声造影剂通过血液循环到达特定的靶组织, 在超声造影显像中能特异性增强靶组织显影,对病灶进行精确定位，明显提高超声诊断的灵敏度和特异度[7]。魏淑萍等[8]在肾癌裸鼠模型中显示MBt较MBc能持续增强显像。本研究表现为MBt持续时间延长， 与该研究一致，与MBc比较,MBt的平均通过时间较长，达峰时间较快(P<0.05)。由于携MMP-2靶向微泡与瘤内的抗原结合使其在瘤体内停留时间延长，因此MBt持续时间、平均通过时间均较长。本研究中部分MBt较MBc峰值强度强，但统计数据未支持，主要原因由于靶向造影时鼠尾静脉较细注射针头未完全进入静脉导致部分靶向造影剂流失组织间隙，进入瘤体内靶向微泡含量降低所致整体的峰值强度在数值上未显示出差异。在MBt消退后期，卵巢癌移植瘤边界较MBc明显清晰，原因是移植瘤基底部的肿瘤侧靶向微泡持续时间长，而非肿瘤侧普通微泡因无靶向微泡的特异结合而快速消退，因此在移植瘤基底部可清晰显示出肿瘤组织的边界；MBc消退后期因无靶向剂的持续性显像作用则无此特征，显示肿瘤组织与周围组织边界不清。这种现象也表现在人体的肿瘤组织与炎性病灶的鉴别中，临床上应用普通造影技术常难以鉴别恶性与炎性肿块，是我们进一步研究靶向造影剂，希望通过靶点定位而提高肿瘤诊断特异性的初衷。MBt参数TTD与离体标本MMP-2数量呈正相关(P<0.05)，也进一步证实携MMP-2的MBt在移植瘤内显影的可行性。

MMP-2与VM均与卵巢癌的恶性度高、侵袭性强有关，Anil等[9]通过免疫组化分析在卵巢癌细胞形成的网络样结构散在表达MMP-1、MMP-2、MMP-9，应用MMP抑制剂，可阻止VM形成，表明MMP-2与VM形成密切相关。本研究离体标本内发现了卵巢癌VM结构，在免疫组织化学中发现大量表达的MMP-2棕褐色颗粒。与Anil等[9]研究一致，即在卵巢癌细胞围成的管状结构中存在MMP-2棕褐色颗粒大量表达。免疫组化中卵巢癌细胞围成的管状结构是否就是CD31/PAS双染色中的VM结构，由于2种显像方法不同，镜下检查不能同时叠加显影，尚不能确定，需进一步证实。但MMP-2与VM数量呈正相关，造影参数TTD与VM数量呈正相关(P<0.05)，说明MMP-2与VM形成密切相关，卵巢癌移植瘤VM应用携MMP-2靶向微泡评价具可行性。

综上所述，携MMP-2的靶向微泡在体内能与特异度表达的MMP-2受体结合并在移植瘤内显影，且MMP-2与VM密切相关，是一个较好的评价卵巢癌微环境VM的靶向位点。可为临床提供以MMP-2为靶点的MBt用于肿瘤的诊断及治疗研究提供动物实验依据。