MRS评价前列腺癌裸鼠皮下移植瘤CIK治疗疗效的研究

古丽妮嗄尔·菲达， 贾 琳， 贾文霄

(新疆医科大学1第二附属医院影像中心， 乌鲁木齐 830063； 2第一附属医院影像中心， 乌鲁木齐 830054)

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，近年来随着我国人口的老龄化，其发病率呈逐年上升趋势[1]。多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是将人的单核细胞从外周血中分离出来，并用白细胞介素IL-2、干扰素γ、CD3单抗等因子进行诱导后培养扩增获得的免疫活性细胞,能够选择性高效杀伤肿瘤细胞，具有很强的体外增殖能力，能够直接或间接的作用于肿瘤细胞，对患者副作用小，安全高效[2]。磁共振波谱成像技术(Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS)是一种磁共振分子成像的方法，能够对机体内特定的原子核以及化合物进行量化分析，无创伤提供组织代谢水平的变化信息，已被广泛应用于临床[3]。MRS技术在前列腺癌早期诊断中的临床应用日渐成熟，能够对前列腺组织中的枸橼酸盐(Citrate, Cit)、肌酸(Creatine, Cre)和胆碱(Choline, Cho)的浓度进行定量检测，通过(肌酸+胆碱)/枸橼酸盐即CC/C值来诊断及鉴别前列腺疾病，MRS可以直观地显示这3种代谢物的峰值变化，为前列腺癌的临床诊断及分级提供影像学依据[4]。目前对于CIK细胞免疫治疗对前列腺癌的疗效研究仅限于临床中的评价方法，影像学研究报道甚少。本研究采用MRS成像技术获得定量参数的方法，研究前列腺癌免疫治疗后肿瘤的抑制状态，为CIK细胞免疫治疗提供影像学依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级BALB/C-nu裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，雄性，6～8周龄，体质量(19.0±1.0)g。

1.2细胞悬液的配制人型前列腺癌PC-3细胞株(购于中科院上海细胞库)，按照无菌操作方法对PC-3细胞进行培养及扩增后胰酶消化配制成细胞悬液。培养和扩增使用的培养基为F-12培养液,10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗,培养箱条件5% CO2、37℃恒温。细胞加入胰蛋白酶进行消化离心后,取对数生长期的PC-3细胞，并用PBS液配制成1×106个/mL细胞浓度的细胞悬液。

1.3CIK细胞的制备取健康人外周血用淋巴分离液将淋巴细胞分离并接种于培养瓶中，完全培养液中加入IFN-γ，置于5% CO2、恒温37℃的培养箱中培养24 h后，分别加入500 U/mL IL-2、100 U/mL IL-1α、和500 Ung/mL CD3单抗，培养液每3 d更换1次，并加入500 U/mL IL-2，培养2 w后获得CIK细胞，收集CIK细胞后对其进行流式检测鉴定其表面标志物。

1.4前列腺癌裸鼠移植瘤模型的分组及建立取“1.2”项下的PC-3细胞悬液以每只裸鼠0.2 mL的用量在裸鼠右后肢背部皮下进行接种。将48只裸鼠随机分为CIK免疫治疗组和空白对照组，每组24只，空白对照组裸鼠连续3 w腹腔注射等量生理盐水，免疫治疗组裸鼠连续3 w在接种部位注射0.2 mL 1×1010/L的CIK细胞悬液。2组裸鼠均于治疗后第7、14、21 d进行磁共振成像扫描，扫描后将2组分别处死8只裸鼠测量肿瘤大小、体积和质量，取肿瘤组织进行病理及肿瘤细胞凋亡检查。

1.5MRS扫描方法采用PHILIPS 1.5T超导型MRI扫描仪动物专用25 mm显微信号采集线圈对实验裸鼠进行扫描，扫描前将载瘤裸鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。常规MRI进行冠状位扫描，扫描序列为TSE-T1WI及TSE-T2WI，扫描层厚2.5 mm，间距0 mm，层数10层。MRS扫描采用PRESS序列，选择冠状面进行扫描，MRS扫描参数：TR=1 700 ms，TE=135 ms，层厚2 mm(可根据肿瘤大小进行调整)，无间隔扫描，层数50层，FOV=60 mm，采集次数(NSA)8次，矩阵128×128，扫描间隔为0。

1.6MRS图像后处理将MRS原始图像使用PHILIPS工作站的专用软件进行后处理，经3名研究人员重复测量ROI及MRS参数并取其平均值，选取感兴趣区时尽量选取同一层面同一位置并且避开肿瘤的坏死及出血区域。由此得到前列腺癌移植瘤的MRS谱线图，软件自动计算得到胆碱、肌酸、枸橼酸盐等主要代谢物的峰高、波峰下面积以及代谢物的比值。

1.7病理学检查及分析方法在免疫治疗前，对收集的CIK细胞进行表型检测(流式细胞术)。治疗后第7、14、 21 d的MRS扫描结束后，每组分别处死8只裸鼠，将剥离出的肿瘤组织浸泡在10%福尔马林溶液中，测量瘤体的体积和重量并进行记录，随后进行常规石蜡包埋、切片并进行常规HE染色及TUNNEL肿瘤细胞凋亡检测，得到前列腺癌细胞的凋亡范围。

2 结果

2.1CIK细胞表型鉴定结果培养14 d后对CIK细胞进行流式细胞检测，分析细胞表型发现，CIK细胞中双阳性CD3+CD56+的比例随细胞培养时间延长而增加,培养14 d后CD3+CD56+的比例达到62.07%，CD4+CD8+的比例达到20.79%。发现CIK细胞经过培养和增殖能够获得稳定表达的多种细胞因子。

2.22组裸鼠MRS各参数测定结果在进行治疗前，空白对照组及CIK免疫治疗组前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的(Cho+Cre)/Cit比值的差异无统计学意义。治疗后，与空白对照组比较，CIK免疫治疗组的(Cho+Cre)/Cit比值持续降低，2组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。对2组裸鼠进行治疗前和治疗第7、14、21d的MRS图像分析发现，与空白对照组比较，CIK免疫治疗组的Cit峰逐渐升高，Cho峰逐渐减低，Cre峰变化无明显差异。而对照组Cit峰逐渐降低，Cho峰逐渐升高，见图1、2。

表1 两组裸鼠皮下移植瘤MRS不同时间节点(Cho+Cre)/Cit比值测量结果

图1 CIK免疫治疗组裸鼠治疗前的MRS图

图2 CIK免疫治疗组裸鼠治疗后MRS图

2.3MRS各参数与病理肿瘤凋亡结果的相关性分析CIK免疫治疗组裸鼠在治疗后2 w内瘤体的体积均有缩小并且瘤体与对照组相比较局限。裸鼠扫描结束后取出肿瘤组织做HE染色,发现CIK免疫治疗组的肿瘤细胞与对照组相比凋亡细胞较多，治疗时间越长，肿瘤细胞出现坏死部分越多，细胞崩解，并且有淋巴细胞浸润。TUNEL检测结果发现CIK免疫治疗组的肿瘤细胞凋亡较对照组增加。将MRS获得的(Cho+Cre)/Cit定量参数与肿瘤凋亡检测结果进行Spearman相关性分析，(Cho+Cre)/Cit比值与肿瘤凋亡检测结果之间均有良好相关性。分析结果发现，(Cho+Cre)/Cit比值与肿瘤细胞凋亡呈负相关，且相关系数较高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 裸鼠皮下移植瘤治疗后(Cho+Cre)/Cit比值与TUNEL结果的相关性分析

3 讨论

MRS技术能够获得组织内部分生物物质的成分和含量信息，并进行量化分析，从分子水平反映组织的病理生理过程[5]。将MRS的代谢信息与常规MRI得到的图像相结合，能够大大提高对肿瘤大小、位置、肿瘤性质的判断，方便临床医师及时制定治疗方案，实时对肿瘤变化进行监测。近年来，国内研究者也逐渐开始对CIK细胞及相关免疫疗法进行各种临床研究，前列腺的MRS检查中最有意义的3种代谢物为枸椽酸盐(Citrate，Cit)、胆碱(Choline，Cho)和肌酸(Creatine，Cre)[6-9]。CIK细胞不仅具有T淋巴细胞的抗瘤活性，还兼具自然杀伤细胞的非MHC限制性杀瘤的优势[10]，能够对肿瘤进行选择性杀伤，并且抗瘤谱广泛，不良反应少，其活性不被免疫抑制剂影响。裸鼠的人肿瘤移植瘤模型能够较好地体现人类肿瘤的特性，能够为探究人体肿瘤的特性、观察各种影像表现以及评价临床治疗后的疗效等提供一个理想的平台[11,12]。CHEN等[13]对前列腺癌移植瘤进行MRS扫描后发现磁共振波谱得到的参数能够有效地鉴别恶性肿瘤组织和正常组织。本研究发现通过MRS图像中Cit和Cho峰的变化直观地观察到CIK免疫治疗后肿瘤组织代谢水平的改变，并且通过(Cho+Cre)/Cit的比值能够将这种代谢改变进行量化。在对2组裸鼠在治疗前和治疗后的4个时期进行MRS扫描后发现，与空白对照组比较，CIK免疫治疗组的(Cho+Cre)/Cit的比值降低，说明MRS得到与代谢相关的参数能够直观地反映肿瘤CIK免疫治疗前后的代谢改变。另外还发现MRS检测到肿瘤代谢的改变早于肿瘤形态学的改变，这也说明了MRS能够在早期就检测到肿瘤的代谢改变，对于早期评价CIK的疗效具有良好的效果。虽然这一结果还需要更多的重复性研究来证明，但是这也肯定了MRS获得的(Cho+Cre)/Cit比值在早期评价CIK疗效中的应用价值。

本研究中前列腺癌裸鼠皮下移植瘤在治疗后7、14、21 d分别处死8只裸鼠进行HE染色及TUNEL检测，对照组裸鼠没有进行干预治疗，肿瘤细胞生长迅速，CIK免疫治疗组裸鼠进行治疗后，肿瘤细胞凋亡速度增加，证明CIK细胞具有抑制肿瘤组织的生长，加速肿瘤细胞凋亡的作用。研究结果表明肿瘤细胞凋亡检测结果与(Cho+Cre)/Cit比值呈负相关，认为这可能是前列腺癌组织分泌Cit的腺管被破坏，导致Cit含量减少，在进行CIK免疫治疗后，由于前列腺癌细胞的凋亡以及免疫反应的增强，Cit的含量与治疗前相比增多。CIK免疫治疗相对其他治疗价格昂贵，能够早期评价疗效对患者后期的治疗方案的确定具有很大的帮助。MRS成像技术作为目前唯一能够量化肿瘤组织代谢水平的影像学技术[14,15]，对于免疫治疗的疗效评价具有很大的应用价值。同时本研究也有一定的局限性，研究中影像学技术所选取的癌灶区域与病理选取的区域很难保持完全一致，存在一定偏差。本研究探讨了CIK免疫治疗对前列腺癌裸鼠移植瘤的治疗效果，结果表明磁共振波谱成像技术获得的定量参数能够很好地反映CIK免疫治疗后肿瘤代谢水平变化的情况，对于CIK免疫治疗疗效的评价是有价值的评价指标，在评价肿瘤内细胞代谢情况和评估肿瘤的治疗疗效方面具有很大的研究价值。