食蟹猴自发性膝骨关节炎模型的中药干预实验

陈巧玉 扶世杰

(西南医科大学，四川 泸州 646000)

近年来，中医药在膝骨关节炎(KOA)的治疗中取得较大进展。独活寄生汤具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功。近年来，该方剂在骨关节炎(OA)的治疗上逐渐受到关注。目前还没有任何药物可以使OA的病情逆转或停止〔1〕，对于KOA软骨组织作用的有效靶点和部位也尚不明确，这可能源于OA中存在更多的各种致病因子及其相关因子、动物模型与人类基因的差异等因素。本文选用与人类基因型和行走方式非常类似的食蟹猴，构建自发性KOA动物模型，以痹证论治KOA理论为依据，采用独活寄生汤进行药物干预，探讨其治疗的有效靶点和部位，为进一步药物治疗的疗效检验及安全性评估提供可靠保证。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级青年型(正常膝关节，年龄3～5岁)和老年型食蟹猴(自发性KOA，年龄≥20岁)各6只，体重4～6 kg，由云南灵长类实验动物有限公司提供。12只食蟹猴适应性喂养2 w，自然光照，温度16～26℃；给予充足的食物和洁静水，允许其自由活动。老年型以生理盐水热敷6 w，随机分为空白对照组和干预组，每组3只；干预组以独活寄生汤热敷6 w。实验过程符合《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2主要实验试剂 PV9000试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色液、TritonX-100、Tween 20，转化生长因子(TGF)-β1抗体(Santa cruz 1∶100)，氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、多聚甲醛、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、乙醇、二甲苯、中性树胶、脱钙液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐缓冲液(粉剂，2 000 ml/袋)、封闭用正常羊血清。

1.3主要实验仪器 超净工作台、离心机、隔水式电热37℃恒温培养箱、超低温冰箱、电热恒温水浴锅、快速混匀器、电子天平、显微镜等。

1.4实验药物 独活寄生汤由西南医科大学附属中医医院药剂科提供，药物组成：独活20 g、桑寄生20 g、杜仲20 g、牛膝20 g、秦艽15 g、防风12 g、细辛6 g、桂心12 g、茯苓20 g、当归12 g、熟地12 g、川芎12 g、路路通15 g、海桐皮15 g、伸筋草15 g、桃仁12 g、红花12 g、丁香15 g、甘草6 g。

1.5标本采集及效应指标测定 将各组食蟹猴仰卧捆绑于动物手术台上，股动脉取血 3 ml置于5 ml试管中，在37℃温箱中温浴0.5～1.0 h后以3 000 r/min离心15 min，然后取血清1 ml置于-20℃冰箱保存。抽取各组食蟹猴右侧膝关节冲洗液(无菌蒸馏水冲洗) 1 ml，肉眼观察关节液性状，包括颜色、透明度和黏稠度，然后以3 000 r/min离心15 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有标本采集完毕后，采用酶联免疫吸附试验检测血清白细胞(WBC)、红细胞沉降率、C反应蛋白(CRP)、关节液肿瘤坏死因子(TNF)-α含量，具体操作严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1青年型和老年型退变膝关节比较 青年型关节液性状透明、清亮、黏稠度中；老年型关节液颜色较深、清亮、黏稠度更高。老年型关节液TNF-α、CRP和红细胞沉降率显著高于青年型(P=0.000)，见表1。

2.2空白对照组与干预组关节液性状变化 与空白对照组(关节液黄、清亮、黏稠度高)相比，干预组干预2 w无明显变化；干预4 w，颜色由黄变为淡黄，黏稠度改变不明显；干预6 w，黏稠度稍有降低。

2.3空白对照组与干预组关节液TNF-α、WBC、红细胞沉降率、CRP含量比较 与空白对照组比较，干预组干预2、4、6 w TNF-α含量明显降低(P=0.000)；WBC、红细胞沉降率含量变化不明显(P>0.05);干预2、4、6 w，干预组CRP含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

与青年型比较：1)P=0.000

表2 干预前后各组关节液TNF-α、WBC、红细胞沉降率、CRP含量比较

3 讨 论

研究发现，食蟹猴自发性OA模型的流行病学和关节病理学改变与人相似〔2～4〕；其关节的大小适中，不但可以满足对于生物化学指标的采集，也能满足放射学和组织学研究。随着年龄老化，会出现典型的OA改变〔5〕；与本实验结果相符。此外，此类动物有较长的生命跨度，是人类慢性疾病的最佳实验材料之一〔6〕。选用食蟹猴自发性KOA 模型能够避免由于人工诱导的OA，更有效地模拟人类KOA发生发展过程，在关节软骨生化改变、OA发病机制、尤其在疗效比较等方面的优势明显。参照《兽医临床病理学 》〔6〕，一般情况下，健康动物的关节液呈无色至淡黄色，澄清透明，含有黏蛋白，故较为黏稠。临床上一般通过主观印象判断。当出现炎症时，由于细胞数和纤维蛋白原含量增加，则出现不同程度的混浊，主观上也可表现为关节液颜色变深；而炎症时透明质酸酶下降导致黏蛋白降解，或因关节液量增多，黏蛋白被稀释可导致黏稠度降低。本实验结果提示，独活寄生汤干预可能减轻因炎症引起的关节液细胞数量增多而导致的混浊，但对于与透明质酸质量相关的关节液黏稠度改变不明显。

研究表明，在KOA患者关节滑液中TNF-α水平增加，参与了关节局部炎症反应；不仅在OA患者，正常软骨细胞采用TNF-α刺激，其基质金属蛋白酶(MMP)-1、3 mRNA和基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-1的表达明显上调〔7〕。TNF-α可通过多途径参与OA，如经典的细胞凋亡途径、MMPs介导的软骨细胞外基质降解，对Ⅱ/Ⅰ型胶原蛋白的诱导分化导致的软骨基质降解。Guo等〔8〕研究发现内质网应激相关分子在OA患者的活性，特别是XBP1S片段在TNF-α处理后表达显著增加。这种联系可能为OA提供新的治疗途径。最新细胞模型和动物实验发现，OA与糖酵解代谢紊乱之间存在一定关系〔9，10〕，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB)3在OA软骨中调节糖酵解作用的表达变化〔11〕，发现PFKFB3在OA软骨组织或TNF-α刺激软骨细胞时的表达下调。OA炎症与这些内源性途径之间存在的关系，可能为OA提供一个潜在的预防或治疗靶点。

在自发性KOA中，患者关节液的WBC常见增高，但外周血WBC改变并不明显。可能是源于自发性KOA的炎症绝大多数属于无菌性炎症。除外合并类风湿关节炎或其他感染性疾病时，可见全血WBC和红细胞沉降率的异常。本实验中，独活寄生汤干预对模型组的全血WBC和红细胞沉降率影响并不明显；从药物治疗的效果来看，随着时间延长，并未呈现降低趋势。这也可能与实验动物模型个体间本身的差异有关。总体说来，全血WBC和红细胞沉降率对于自发性OA的诊断价值有限，但可作为关节炎鉴别诊断和疗效判断的指标之一。

CRP是在感染和组织损伤时血浆浓度快速、急剧升高的主要急性炎相期蛋白。传统观点认为CRP为非特异性的炎症标志物，常作为反映类风湿关节炎疗效的指标。其与风湿性关节炎病情及骨质破坏的发生和发展呈正相关。但在OA诊断中，CRP的检测意义往往并不具特异性，而常被作为疗效判断的指标之一。一份关于KOA疼痛患者CRP变化的回顾调查结果显示，在1 156例检测CRP的患者中，CRP异常者占5.5%(64例)，检测的834例患者中，异常者占23.14%(193例)〔12〕。CRP虽不能作为诊断OA的特异性指标，但对于炎症严重者及OA合并类风湿关节炎或伴随其他感染性疾病的鉴别诊断，其检测具有重要参考价值。

随着检测技术的不断发展，临床上可以用新的敏感方法检测出低浓度CRP，称为高敏CRP (hs-CRP)。目前，hs-CRP 已被证实是由细胞因子尤其是白细胞介素(IL)-6 刺激而产生，与慢性低水平活动的细胞因子相关，是慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素〔13，14〕。一项对大样本的中老年人群(包括健康人群、OA早期患者)血浆hs-CRP水平的检测结果显示，OA组明显高于对照组，与炎症程度正相关，说明OA患者在早期有炎症存在〔15〕。另有对比研究发现，处于KOA活动期表现为关节疼痛的患者，其血浆hs-CRP水平明显高于放射学(无症状)的KOA患者，且后者血清hs-CRP水平高于正常对照组〔16〕。hs-CRP在OA早期阶段可能具有诊断意义，有望成为OA的常规检测手段。但hs-CRP参与OA具体机制尚不清楚。国外有研究认为，hs-CRP 可能诱导了IL-6的分泌，激活巨噬细胞表达细胞因子，也可能放大了其他介质的炎症前作用〔17，18〕。

最新关于独活寄生汤治疗OA的Meta分析显示，该方剂可改善KOA患者的临床症状，缓解患者疼痛，其疗效优于西医治疗〔19，20〕。但具体的作用机制与途径还不十分清楚；在临床长期持续的疗效方面还有待验证；对于不同人群存在疗效差异，也还缺乏较充分的临床研究数据。本研究结果显示，独活寄生汤干预对食蟹猴自发性KOA关节液TNF-α有直接抑制作用，能够降低全血WBC及CRP水平。

此外，最新研究发现的一些与OA疾病严重程度相关的潜在生物标志物，如：血清和滑膜中抵抗素〔21〕、Ihh〔22〕、Toll样受体〔23〕；与软骨修复和重塑相关的干细胞或祖细胞(CSPCs)〔24〕，一些软骨基质蛋白酶，如软骨蛋白激酶B(Akt)、蛋白激酶(PK)Cα也参与了OA的进展〔25〕。其复杂的相互作用，独活寄生汤与其是否有作用及其机制，有待进一步探索。