SNP rs10757278、IFNα21与冠心病关系的研究

吕昊阳 王岩 鞠礼 孙涵文 高益民 张明宇

[摘要] 目的 研究9p21染色体SNP rs10757278、干扰素α21（IFNα21）和冠心病发生之间的关系。 方法 连续选取200例冠脉造影患者，分为两组，对照组100例：管壁光滑无动脉硬化斑块或血管狭窄<50%；实验组100例：冠脉造影血管狭窄>50%，检测入组患者IFNα21蛋白浓度和9p21基因rs10757278（G）。 结果 rs10757278为AA时 IFNα21浓度为（29.81±10.73）μg/L，rs10757278为AG时IFNα21浓度为（39.70±10.22）μg/L，rs10757278为GG时 IFNα21浓度为（57.62±11.26）μg/L，组间差异有统计学意义（P<0.05）。早发冠心病组IFNα21浓度为（56.17±11.21）μg/L，相同年龄非冠心患者群IFNα21浓度为（48.63±10.31）μg/L，两者之间差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 IFNα21蛋白的表达和rs10757278（G）风险等位基因呈剂量依赖关系，IFNα21蛋白浓度和早发冠心病的发生率之间呈正相关性。

[关键词] SNP rs10757278；冠脉造影；干扰素α21蛋白；冠心病

[中图分类号] R394.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0012-04

[Abstract] Objective To study the relationship between 9p21 chromosome SNP rs10757278， interferon α21 （IFNα21） and coronary heart disease. Methods 200 patients with coronary angiography were consecutively selected and divided into two groups including control group and experimental group. 100 patients in the control group had smooth atherosclerotic plaque or vessel stenosis <50%. 100 patients in the experimental group had coronary angiography vascular stenosis>50%. The IFNα21 protein concentration and 9p21 gene rs10757278（G） of the patients were detected. Results The IFNα21 concentration was（29.81±10.73）μg/L when rs10757278 was AA. The IFNα21 concentration was（39.70±10.22）μg/L when rs10757278 was AG. And the IFNα21 concentration（57.62±11.26）μg/L when rs10757278 was GG. There was significant difference between groups（P<0.05）. The concentration of IFNα21 in premature coronary heart disease group was（56.17±11.21）μg/L， and the concentration of IFNα21 in non-coronary heart disease patients of the same age was（48.63±10.31）μg/L， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion There is a dose-dependent relationship between the expression of IFNα21 protein and the risk allele of rs10757278（G）， and there is a positive correlation between the concentration of IFNα21 protein and the incidence of premature coronary heart disease.

[Key words] SNP rs10757278； Coronary angiography； Interferon α21 protein； Coronary heart disease

冠心病是目前導致人类死亡的主要疾病之一。大量的全基因组关联研究实验发现，冠心病具有一些相关联的疾病易感基因多态性（SNP）[1-3]，这些SNP大多位于染色体9p21区域，但这些SNP改变导致冠心病发病率升高的具体作用机制尚不清楚。Harismendy等[4]研究认为染色体9p21区域SNP通过干扰素α21（IFNα21）途径导致冠状动脉粥样硬化高发。本项目选取2014年1月～2014年12月在哈尔滨医科大学附属第四医院心血管内科进行冠状动脉造影的患者，目的是研究SNP rs10757278、IFNα21和冠心病发生之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

连续选取2014年1月～2014年12月期间在哈尔滨医科大学附属四院心血管内科住院并进行冠脉造影的患者200例，排除标准：①外周血管疾病患者；②急性心肌梗死患者；③急性肺栓塞患者。根据冠脉造影结果将入组患者分为两组：对照组100例：管壁光滑无动脉硬化斑块或血管狭窄<50%；实验组100例：冠脉造影血管狭窄>50%。入组病例采静脉血5 mL，经2000转/min离心10 min取血清2 mL，在-80℃冰箱保存，等待进一步检验INFα21蛋白浓度、9p21基因rs10757278（G）。

1.2 实验方法

首先在GeneBank中查询并获得染色体9p21基因SNP rs10757278的cDNA序列，参考相关文献设计，由Invitrogen公司进行引物的设计及合成。rs10757278的上游引物：5-TATTACAAATAGCTTCTCCACC-3；下游引物：5-TATTGTCTGCC-TTACATGTGCTAT-3；延伸引物：5-CGACTGTAGGTGCGTAACTCTGCGTCAA-ATCTAAGCT-GAGTGTTG-3。采用双蒸水将DNA稀释到浓度10 ng/μL，将PCR引物稀释到最终浓度为10 μmol/L，再将延伸物稀释到最终浓度为10 μmol/L。然后依次加入引物、dNTP、缓冲液、氯化镁、Taq酶及稀释后的DNA。对扩增循环参数进行调控，将其设定为在95℃变性15 min，然后94℃变性30 s、55℃退火30 s、再72℃延伸1 min，以上扩增步骤反复循环40次，最后将产物于4℃進行保存。向扩增产物中加入纯化液3 μL，并设置纯化反应条件为：37℃ 30 min，96℃ 10 min，后产物于4℃进行保存。再向每个样本中加入引物6 μL进行反应混合物的延伸，将反应条件设置为96℃ 3 min，然后进入94℃ 20 s，40℃ 10 s循环40次，产物于4℃进行保存。取10 μL延伸物加入杂交板，在42℃进行杂交，时间为2 h。通过SNP Stream基因分型系统来扫描分析。

采用ELISA方法测定IFNα21水平将保存的血清室温溶解，将50 μL不同浓度的标准品加入标准品孔中，将40 μL样本稀释液及10 μL血清加入样本孔中。将100 μL检测抗体用过氧化物酶标记后加入样本孔及标准品孔中，然后反应孔用封板膜封住，在37℃恒温箱保存60 min。弃去上清液，每孔加洗涤液至满，放置2 min，甩去液体后在纸上拍干。重复操作5次上述步骤。将加入底物A 50 μL加入每孔中，然后再加入底物B 50 μL至孔中，避光在37℃条件下孵育15 min。于每孔加入终止液50 μL，在450 nm波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线图：应用Excel工作表，标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制出标准品的线性回归曲线，通过曲线方程计算各样本浓度值。

1.3 观察指标

rs10757278的碱基G表达，IFNα21蛋白的表达和冠心病发生之间的关系。

1.4 统计学分析

应用SPSS20.0软件，组间计量资料比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义，使用多变量回归分析IFNα21与早发冠心病的发生相关性。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

入选患者200例。根据冠状动脉造影结果分为两组，对照组100例，实验组100例，两组之间低密度脂蛋白（LDL-C）、BMI、高血压史、吸烟史、糖尿病史进行统计，两组间LDL-C、吸烟史、高血压病史及糖尿病病史同对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 IFNα21蛋白的表达和rs10757278（G）关联性

IFNα21蛋白在纯合子A基因型中表达最低，而在纯合子G基因型中表达最高。通过独立样本t检验分析，差异有统计学意义（P<0.05）。研究结果发现IFNα21蛋白的表达和rs10757278（G）风险等位基因成剂量依赖关系。见图1。

2.3 IFNα21蛋白与早发冠心病相关性分析

在200例患者中符合早发冠心病诊断的共有39例为早发组，其中男23例（58.9%），女16例（41.1%）。在对照组中筛选与早发组年龄相近，共41例为对照组I，其中男19例（46.3%），女22例（53.7%）。采用多变量回归分析校正LDL-C，吸烟史、高血压病史、糖尿病史等变量。表2显示：早发组的吸烟史、高血压史、糖尿病史与对照组差异有统计学意义（P<0.05），其中高血压患病率对照组Ⅰ高于早发组，而吸烟史率、糖尿病史率早发组高于对照组Ⅰ，结果分析：早发组低密度脂蛋白、IFNα21蛋白浓度与对照组Ⅰ差异有统计学意义，早发组低密度脂蛋白、IFNα21蛋白浓度均高于对照组Ⅰ。我们发现IFNα21蛋白浓度和早发冠心病的发生率之间呈正相关性，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

3 讨论

根据流行病学统计，我国心血管疾病患病率目前逐年上升，现阶段患病总人数已达2.9亿。冠心病是由基因因素和生活方式共同作用导致的多性状复杂疾病，年龄、性别、吸烟、BMI指数、高血压、高血脂和糖尿病等都是冠心病的易感因素，同时研究结果显示冠心病受遗传因素影响显著[5-7]。目前大多数全基因组关联研究是在欧美人群中进行的[8]，其结果未必完全适用于中国人群，因此寻找和验证中国人群特异性与动脉粥样硬化相关的基因和位点，以及发现已报道位点在中国人群中是否具有不同的遗传表现形式，是我们在冠心病分子遗传学研究的重点之一。既往研究中显示中国汉族人群中9p21区域中SNPrs10757278、rs1333040、rs2383207、rs10116277与冠心病易感性相关[9-11]，我们在先前实验也证实中国汉族人群SNP rs10757278中的G等位基因为冠心病患病的风险等位基因，AG及GG基因型为冠心病的危险基因型，同时也有多项研究发现rs10757278和颈动脉狭窄、猝死等多种动脉硬化疾病相关[12，13]。

冠心病是属于复杂疾病，特点是由多处基因突变而不是单一基因变异介导，每一个SNP对疾病的发生产生微小影响，但多个基因叠加到达阈值则导致冠心病的发生。所以SNP是通过那种生物学途径影响其转录调节功能，从而增加冠心病患病风险仍是研究热点[14]。Harismendy研究推测Ⅰ型干扰素参与9p21的染色体结构转录调节功能，参与单核苷酸多态性对性状的表达。根据IFNα21在不同人群中表达的测定结果，将其与rs10757278等位基因间进行比较，我们发现IFNα21蛋白在AA基因型中表达最低，而在GG基因型中表达最高。通过独立样本t检验分析，差异有统计学意义（P<0.05），说明IFNα21蛋白的表达和rs10757278（G）风险等位基因成剂量依赖关系，两者呈正相关，那么SNPrs10757278造成冠心病高发是否是由IFNα21蛋白表达异常造成的？Glett等[15]以欧洲白种人为研究对象，通过对冠心病易感基因rs1333049作用的途径研究，得出结论染色体造成冠心病高发不是由于Ⅰ型干扰素途径所造成。Christopher等[16]研究也报道冠心病的发病率增加同Ⅰ型干扰素的剂量之间并无相关性。多数危险因素的试验研究都来源某一种族，而对于其他种族是否适用并不确定。

我们在此前的研究中也得出相似结论，在冠脉造影确定的冠脉粥样硬化程度不同的群体之间IFNα21蛋白表达并没有统计学差异[17]。在本文中我们进一步研究IFNα21与亚组早发冠心病发病率之间的关系，实验结果显示已知的吸烟、糖尿病、LDL-C和高血压病史等因素早发冠心病组高于对照组数据。IFNα21蛋白浓度在早发冠心病组为（56.17±11.21）μg/L，而对照组浓度为（48.63±10.31）μg/L，通过回归分析校正年龄、性别、LDL-C、吸烟、糖尿病史和平均血压变量后，两组之间进行比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明IFNα21蛋白的浓度与早发冠心病的发生密切相关，在今后的研究中我们将进一步确认IFNα21蛋白可否作为生物标记物来优化冠心病的风险评估及预防。

综上所述，我们得出结论：（1）SNP rs10757278與IFNα21蛋白呈正相关；（2）干扰素α21蛋白与中国汉族人群早发冠心病的发生具有相关性。

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（收稿日期：2018-03-22）