Sonovue超声微泡介导DNCREB重组质粒转染人肾癌786—O细胞的实验研究

黄帅帅 王雪 姚许平 翁国斌 任雨

[摘要] 目的 本研究旨在探讨Sonovue超声微泡介导DNCREB转染对人肾癌786-O细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法 构建裸鼠肾癌荷瘤模型，将负显性突变体DNCREB重组质粒结合至Sonovue超声微泡，经尾静脉注射后，在体表瘤块位置给予1 MHz、声强1 W/cm2靶向超声辐照，诱导微泡破裂产生空化效应并释放DNCREB进入靶细胞，观察并记录肿瘤大小变化。使用MTT和流式细胞术分别观察细胞增殖、周期和凋亡情况的变化。 结果 待超声辐照处理后，相比于Vector组和Control组，DNCREB组细胞增殖能力明显受抑制、细胞周期发生S期阻滞、细胞凋亡率显著性增加，同时伴随着细胞周期蛋白cyclin A和凋亡相关蛋白的Bcl-2表达下调。此外，动物实验发现：与Vector组或Control组相比，DNCREB组的瘤块生长能力显著受抑制。 结论 Sonovue超声微泡介导DNCREB重组质粒转染有效地抑制了肾癌细胞的发生发展过程。

[关键词] 超声微泡；DNCREB；肾癌；增殖；周期；凋亡

[中图分类号] R737.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the influence of transfection of DNCREB recombinant plasmid mediated by Sonovue ultrasonic microbubble on the proliferation， cycle and apoptosis of human renal cancer 786-O cell. Methods Tumor bearing model of renal cancer in nude mice was established. Recombinant plasmid of negative dominant mutant of DNCREB was combined with Sonovue ultrasonic microbubble. After caudal vein injection， targeted ultrasonic irradiation of 1MHz and sound intensity 1 W/cm2 was given in the tumor location of body surface to induce the microbubble destruction to generate the cavitation effect and release DNCREB into target cells. The size change of tumor was observed and recorded. Results After the ultrasonic irradiation， compared with Vector group and Control group， cell of DNCREB group showed significantly inhibited ability of proliferation， S arrest of cell cycle and significantly increasing apoptosis rate， along with down-regulated expression of cyclin A and apoptosis-related protein Bcl-2. Moreover， animal experiment showed： compared with Vector group and Control group， the growing ability of tumor in DNCREB group was significantly inhibited. Conclusion Transfection of DNCREB recombinant plasmid mediated by Sonovue ultrasonic microbubble inhibited the occurrence and development process of renal cancer cell effectively.

[Key words] Ultrasonic microbubble； DNCREB； Renal cancer； Proliferation； Cycle； Apoptosis

肾癌源于肾小管上皮细胞恶变，其发病率较高并以2%的速度逐年增长，然而其发病机制目前尚不清楚[1，2]。近年来，原癌基因的异常表达与肾癌之间的相关性研究已成为肿瘤病因学研究的热点。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）作为调控细胞各种行为的转录因子，其Ser-133位点受磷酸化后，能与目的基因的CRE反应元件结合，从而激活靶基因的转录过程。已有文献报道，在多种肿瘤中磷酸化CREB（Phosphated CREB，pCREB）水平呈高表达状态[3，4]。我们的前期研究也发现，肾癌细胞/组织中pCREB水平显著性高于正常肾细胞/组织[5，6]。因此，我们欲通过转染负显性突变CREB（Dominant negative CREB，DNCREB）抑制肾癌细胞的发生发展。本研究旨在研究超声微泡介导DNCREB转染人肾癌786-O细胞后的变化，并深入探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人肾癌细胞株786-O购自中国科学院细胞库。RMPI 1640、胎牛血清均购自美国Gbico生物公司；pCREB、CREB、GAPDH兔单克隆抗体及Bcl-2鼠单克隆抗体均购自Cell signaling technology公司；小鼠單克隆Cyclin A、CDK2抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗兔IgG二抗及羊抗鼠IgG二抗均购自武汉博士德生物公司；细胞周期及凋亡试剂盒均购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2 细胞培养

人肾癌细胞株786-O接种于RMPI 1640培养基，培养基中含10%胎牛血清，100 mg/L链霉素及1.0×104 IU/L青霉素，培养于37℃、5% CO2饱和湿度的孵箱中。

1.3 DNCREB质粒转染

在前期实验中，我们构建了Ser-133位点突变的DNCREB重组质粒[7]。因此，本实验将细胞分组为：①空白对照组（Control组）；②pCI neo空质粒组（Vector组）；③DNCREB组。转染过程如下：将6孔板置于超声探头上方，探头上涂少量耦合剂，紧贴6孔板下方。我们预实验研究表明：当质粒质量为30 μg、造影剂浓度为10%（v/v）、MI指数为0.6、辐照时间5 min时，质粒转染率最高。待转染完成后，37℃培养箱继续培养6 h后更换新鲜培养基，继续培养24 h。

1.4 Western blot实验

取对数生长期786-O细胞，以2.0×104个/孔密度接种于6孔板。待超声微泡介导转染后，更换完全培养基，待细胞生长48 h，裂解，RIPA法提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，4℃冰箱中一抗（1：1000）孵育过夜，TBST清洗3次，相应的二抗（1：5000）孵育1 h，曝光，结果以蛋白相对表达量（目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值）显示。

1.5 MTT实验

在25 cm2瓶中培养786-O细胞至对数生长期，按上述分组，待超声微泡介导转染后，胰酶消化，接种至96孔培养板，接种密度为2.0×103个/孔，每组设6个复孔，每孔加入100 μL完全培养基，培养24 h。以未处理的培养液孔为阴性对照组。待24 h后，每孔均加入20 μL MTT，37℃培养2 h，492 nm测吸光度值。

1.6 细胞周期实验

将细胞以1.0×106个/瓶的密度接种于25 cm2细胞瓶中，待细胞融合至50%左右时，超声法转染Vector和DNCREB质粒，24 h后胰蛋白酶消化并收集细胞，离心，PBS重悬2次，每个样品加入PI/RNase染料100 μL混匀，避光孵育15 min，置于流式细胞仪检测。

1.7 细胞凋亡实验

待超声微泡介导质粒转染人肾癌细胞786-O细胞后，胰酶消化，PI及FITC标记的Annexin V染色10 min，置于流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.8 裸鼠成瘤实验

注射100 μL浓度为5.0×107个/mL的786-O细胞于4周龄的裸鼠背部皮下，观察并记录瘤块体积变化，体积V=L×W2×π/6（V：体积，L：长度，W：宽度）mm3。

1.9 统计学方法

使用SPSS18.0软件做统计学处理，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两组间比较采用Dunnett-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Sonovue微泡介导DNCREB转染后对786-O细胞增殖能力的影响

Western blot结果显示：与Vector组相比，DNCREB组中tCREB表达量明显上调，pCREB水平下调（表1）。此外，MTT实验结果表明DNCREB组在转染786-O细胞48 h后增殖能力显著性下调（图1）。

2.2 Sonovue微泡介导DNCREB转染后对786-O细胞周期及相关蛋白的影响

Sonovue微泡处理后，流式细胞术结果表明，与Vector组或Control组相比，DNCREB的S期数量显著性增加。同时，其细胞周期相关蛋白Cyclin A表达量下调，然而CDK2表达量却无明显改变（表2）。

2.3 Sonovue微泡介导DNCREB转染后对786-O细胞凋亡及相关蛋白的影响

Sonovue微泡处理后，流式细胞术结果表明，Vector组与Control对照组相比，细胞凋亡数量并无显著性变化，而DNCREB处理后，凋亡数量显著性上调，伴随着细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的显著性下调（表3）。

2.4 Sonovue微泡介导DNCREB转染后对裸鼠皮下成瘤能力的影响

裸鼠成瘤实验表明，Control组和Vector组在接种8 d后开始出现肿瘤，直至接种5周后，瘤块体积分别为（206.24±34.47）mm3、（171.42±47.85）mm3，两组之间瘤块大小并无显著性差异。然而，DNCREB组瘤块体积生长缓慢，生长至2周后体积为（16.83±13.86）mm3，与Control组（55.24±15.31）mm3或Vector（44.42±15.83）mm3相比，出现显著性差异（图2）。

3 讨论

转录因子CREB与肿瘤发生发展密切相关。转录因子CREB受cAMP信号激活，从而调控目的基因的表达[8]。有文献表明，CREB活化与多种肿瘤疾病的不良愈后呈正相关，这也预示着pCREB高表达很可能是肿瘤不良愈后的高危因素[5，9]。本研究利用原癌基因CREB的负显性突变体DNCREB，证实了pCREB水平的下调可以抑制肾癌细胞增殖、诱导肾癌细胞凋亡和促进细胞周期阻滞等过程。有研究显示，CREB活化水平受上游激酶如AKT等调控，从而结合下游细胞周期相关基因的CRE序列，进而影响细胞周期进程[10，11]。在Dworet等[12]的研究中，他们发现A-CREB诱导甲状腺细胞凋亡，并延迟S期进展。另有研究报道，DNCREB能有效抑制DMBA诱导的皮肤乳头状瘤块生长，同时引起cyclin B1和cyclin D1蛋白的表达改变[13]。在我们的实验中也发现：DNCREB诱导786-O细胞发生S期阻滞，这一结果可能与DNCREB转染后引起细胞内cyclin A蛋白表达量改变有关。与此同时，我们的研究还发现DNCREB转染后调控了细胞增殖和凋亡过程。Bcl-2作为肿瘤细胞内原癌基因，能阻止凋亡誘导因子如细胞色素c释放，从而抑制细胞凋亡[14，15]。我们先前通过生物信息学软件显示：Bcl-2基因转录起始位点中具有能与CREB结合的CRE位点，因此本研究结果也提示Bcl-2受CREB调控，其改变可能参与调节凋亡诱导因子的释放，从而介导细胞凋亡过程。

鉴于DNCREB对肾癌细胞的抑制作用，使基因疗法成为了可能。然而，传统的病毒转染与脂质体转染方式因其具有安全性低和转染率差等缺点，限制了DNCREB在靶细胞中发挥作用[16，17]。与传统基因载体不同，Sonovue微泡造影剂介导的基因转染克服了这一缺点。Sonovue微泡受到超声辐照后，可产生连续的压缩膨胀，使得微泡破裂，伴随着产生的空化效应致使靶区组织或细胞膜结构通透性增加，促进基因进入靶细胞，这种空化效应在血栓、肿瘤和炎症组织中已有初步研究[18-20]。Shi等[21]在研究超声微泡介导Soxp3 siRNA转染抑制肝癌Treg细胞时，他们发现当微泡浓度为10%、超声暴露时间为150/180 s、MI指数为1.4时，其基因转染率达到了50%，Treg细胞活性抑制率最高。我们的预试验也对超声转染参数做了优化，并且在此条件下动物实验结果显示DNCREB转染组裸鼠荷瘤的生长能力显著受抑制，这个结果也初步证明了Sonovue微泡作为一种无创安全的方式、又能提高DNCREB的转染效率，更有利于基因靶向治疗，也可能成为一种新型的抑制肿瘤发生发展的新方法。

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（收稿日期：2018-02-12）