错配修复基因蛋白在结直肠癌诊治中的临床应用*

邱春华 张志宏 董丹丹 李良平

结直肠癌是中国常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居第3位和第5位［1-2］。研究发现，DNA错配修复基因（mismatch repair gene，MMR）的突变或甲基化，导致微卫星不稳定性（microsatellite instabili⁃ty，MSI），是结直肠癌发生的重要机制之一［3］。占结直肠癌3%～5%的Lynch综合征是由于MMR发生胚系突变所致的常染色体显性遗传性疾病。而在15%散发性结直肠癌中，错配修复基因MLH1启动子甲基化失活是其主要的发生机制，临床特征与Lynch综合征相似。2014年美国国家综合癌症网络（NCCN）推荐初诊结直肠癌患者应筛查Lynch综合征［3］。

本研究采用免疫组织化学法检测结直肠癌患者手术标本中MMR的表达情况，及其与临床病理学的关系，并评价其在Lynch综合征和散发性结直肠癌筛查中的价值，以期为临床筛查Lynch综合征提供简便、快速、经济的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 选取四川省人民医院2015年1月至2016年9月收治的结直肠癌患者607例，均经术后病理确诊，其中男性376例（61.94%），女性231例（38.06%）；年龄26～90岁，平均年龄63岁；排除术前接受过放化疗的患者。采用免疫组织化学LDP法检测切除的肿瘤组织标本中MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达和P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40的表达情况，及与临床病理的关系。本研究获得四川省人民医院伦理委员会的批准［伦审（研）2018年第149号］。

1.1.2 主要试剂 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 采用免疫组织化学LDP法。将患者手术切除的肿瘤标本，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，5 μm连续切片。按产品说明书操作，第一抗体分别为MLH1（鼠单抗，1:10）、MSH2（兔单抗，1:100）、MSH6（兔单抗，1:100）、PMS2（兔单抗，1:20）、P53（鼠单抗，1:100）、VEGF（兔多抗）、Ki-67（鼠单抗，1:100）、CD34（鼠单抗，1:100）、D2-40（鼠单抗，1:25），采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，MLH1、MSH2以正常结肠黏膜上皮表达情况作为阳性对照。MSH6、PMS2以结肠癌表达情况作为阳性对照。P53以乳腺癌表达情况作为阳性对照。VEGF以肝癌表达情况作为阳性对照。Ki-67、D2-40以扁桃体表达情况作为阳性对照。CD34以血管内皮表达情况作为阳性对照。

1.2.2 结果判定 结合染色强度和阳性细胞百分比进行判断［4］，由两位病理科医生独立完成结果判定。

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、P53、Ki-67蛋白均位于细胞核，VEGF蛋白定位于细胞质/细胞膜，CD34定位于血管内皮细胞的胞质。D2-40蛋白定位于淋巴管细胞质，呈黄色或棕黄色染色为表达（+），不着色为缺失（-）。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白中任意一种不表达判定为MMR表达缺失，而MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白均表达则判定为MMR完整。

1.2.3 随访 每3个月随访1次，门诊随访和电话随访相结合，根据患者的检查结果、治疗方案，观察总体生存和无瘤生存情况。随访时间为20～40个月，截至2018年4月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR在结直肠癌中的表达

607例标本中，共 216例 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达缺失，MMR表达缺失率为35.58%。其中男性136例，女性80例，年龄≤50岁41例。将216例MMR蛋白表达缺失患者设为阴性组，391例表达正常患者设为阳性组，两组在肿瘤位置比较（左半结肠vs.右半结肠，直肠vs.右半结肠）差异具有统计学意义（P＜0.01，表1），MMR蛋白阴性组右半结肠癌高发，阳性组左半结肠癌和直肠癌高发。两组年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 MMR蛋白在结直肠癌中的表达

2.1.1 MMR一项表达缺失结果 MMR一项表达缺失，分别以MLH1、PMS2蛋白表达缺失为主。MLH1蛋白表达缺失率为3.95%，表达缺失组右半结肠8例，左半结肠+直肠16例；表达阳性组右半结肠60例，左半结肠+直肠331例。两组在肿瘤位置的比较（左半结肠/直肠vs.右半结肠），差异具有统计学意义（P＜0.05）。PMS2蛋白表达缺失率为11.04%，表达缺失组右半结肠17例，左半结肠+直肠50例；表达阳性组右半结肠60例，左半结肠+直肠331例。两组在肿瘤位置的比较（左半结肠/直肠vs.右半结肠），差异具有统计学意义（P＜0.05）。MLH1蛋白、PMS2蛋白阴性组右半结肠癌高发，阳性组左半结肠癌和直肠癌高发。

2.1.2 MMR多项表达缺失结果 MMR联合两项表达缺失，以MLH1/PMS2联合表达缺失为主。MLH1/PMS2蛋白表达缺失率为14.50%，表达缺失组右半结肠49例，左半结肠+直肠39例；表达阳性组右半结肠60例，左半结肠+直肠331例。右半结肠癌MLH1/PMS2蛋白表达缺失率明显高于左半结肠癌和直肠癌（P＜0.01）。MMR三项联合表达缺失 6例，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6同时表达缺失4例。

2.2 MMR蛋白表达与临床病理学关系

MMR蛋白表达缺失的阴性组，高/中分化146例，低分化70例；表达正常的阳性组，高/中分化313例，低分化78例。两组在肿瘤分化程度（高/中分化vs.低分化）的比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，表2）。MMR蛋白表达缺失的阴性组，Ⅰ/Ⅱ期87例，Ⅲ期129例；表达正常的阳性组，Ⅰ/Ⅱ期190例，Ⅲ期201例。两组TNM分期（Ⅰ/Ⅱvs.Ⅲ）比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，表2）。MMR蛋白表达缺失的阴性组，有淋巴结转移67例，无淋巴结转移149例；表达正常的阳性组，有淋巴结转移199例，无淋巴结转移192例。两组淋巴结转移比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，表2）。两组肿瘤大小比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组肿瘤病理类型的比较显示，与黏液/印戒分化无关，与淋巴细胞浸润无关，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 MMR蛋白在结直肠癌中的表达与病理学关系

2.3 P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40在结直肠癌中的表达

MMR蛋白表达缺失的阴性组，VEGF阳性152例，阴性64例；表达正常的阳性组，VEGF阳性334例，阴性57例，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01，表3）。MMR蛋白表达缺失的阴性组，Ki-67在1%～50%有97例，51%～100%有119例；表达正常的阳性组，Ki-67在1%～50%有132例，51%～100%有259例，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01，表3）。左半结肠癌和直肠癌的VEGF、Ki-67表达水平高于右半结肠癌。MMR蛋白表达缺失的阴性组和表达正常的阳性组P53、CD34、D2-40的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 VEGF、Ki-67在结直肠癌中的表达

3 讨论

2017年中国癌症数据报告显示结直肠癌的发病率呈明显上升趋势，分别位居男性肿瘤发病率的第4位，女性的第3位，城市年发病率高达33.17/10万人［1-2，5］。有研究发现，MMR突变或甲基化导致的MSI，是结直肠癌发生的重要机制之一［3］。本研究在MMR蛋白表达缺失中分别以MLH1、PMS2、MLH1/PMS2蛋白表达缺失为主，提示MMR蛋白表达阴性组右半结肠癌高发，阳性组左半结肠癌和直肠癌高发。右半结肠癌和左半结肠癌在胚胎来源、分子特征、致癌机制等方面存在差异。右半结肠癌与MMR缺失、MSI阳性表达、MLH1基因甲基化、BRAF基因突变等相关，左半结肠癌与抑癌基因APC、P53等的失活、KRAS基因突变相关［6］。

发病部位为MLH1/PMS2蛋白表达的独立影响因素。若MLH1/PMS2蛋白缺失，可进一步安排BRAF V600E突变和MLH1启动子区甲基化的检测，如结果为阴性应进行MLH1/PMS2基因种系突变检测，根据结果确定是否为Lynch综合征［7-8］。本研究两组患者在肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移方面比较，差异均有统计学意义。术后定期随访发现，MMR蛋白表达缺失的阴性组，复发转移8例，死亡2例；MMR蛋白表达正常的阳性组，复发转移21例，死亡7例。有研究提示发病部位、TNM分期是MMR蛋白表达的独立影响因素［9］。MMR蛋白表达缺失的结直肠癌有其独特的生物学行为特征，中国多项研究发现，肿瘤多位于右半结肠，肠外恶性肿瘤发病率较高，低分化腺癌常见，肿瘤预后好于散发性大肠癌［7，10］。家族史、低龄、右半结肠肿瘤、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤侵入固有肌层为中国可疑Lynch综合征患者的高危临床病理学因素［11］。

本研究两组患者VEGF、Ki-67的比较，差异具有统计学意义，远端结肠和直肠癌的VEGF表达水平高于近端结肠癌。肿瘤原发部位基因表达和突变的差异，影响化疗和分子靶向药物的效果，导致左、右半结肠癌患者的预后不同［12］。抗血管生成抑制剂贝伐珠单抗靶向治疗的疗效和部位存在明显关系，根据原发瘤部位选择结直肠癌靶向治疗，对现有治疗方案选择产生深远影响［5］。Bendardaf等［13］研究显示，在CAPEOX+贝伐珠单抗治疗的患者中，与盲肠和升结肠癌比较，乙状结肠和直肠癌的中位无进展生存时间和生存时间显著延长。有研究发现，P53参与腺瘤-癌变途径，可能仅对左半结肠癌有预后价值［14］。

Lynch综合征占结直肠癌的3%～5%，是MMR发生胚系突变所致的常染色体显性遗传性疾病，具有患癌风险明显增加、加速的癌变进程、发病年轻化等特点，需要与散发性结直肠癌鉴别［10］。对结直肠癌患者手术标本进行MMR的检测，可以筛查Lynch综合征患者和家族成员，避免漏诊。近期国内外指南和共识推荐结直肠癌患者进行MMR免疫组织化学或MSI的检测，筛查Lynch综合征［3，7］。MMR的检测对外科决策较为重要，对于年轻的Lynch综合征相关结直肠癌患者，推荐扩大结肠切除范围［15］。在15%散发性结直肠癌中，MLH1启动子甲基化失活是其主要的发生机制，临床特征与Lynch综合征相似，肿瘤多位于右半结肠，病理分期以Dukes B期为主，病理形态以隆起型多见，MLH1表达缺失率高于MSH2等，需要与Lynch综合征鉴别［3，7］。

MMR在Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者中可作为预后较好的生物学标志物［16］。某一MMR基因突变所导致的微卫星不稳定增高（MSI-H），预示对氟尿嘧啶化疗缺乏敏感性，不能从中受益［17］。结直肠癌的免疫治疗中，dMMR/MSI-H是预测抗PD-1单抗疗效的标志物。2017版NCCN指南中首次将免疫检查点抑制剂PD-1单抗pembroli⁃zumab和nivolumab推荐用于具有dMMR/MSI-H分子表型的结直肠癌的末线治疗［18］。MMR基因突变检测为Lynch综合征诊断的“金标准”，但因费用较贵限制了其临床应用。患者的手术标本先进行MMR免疫组织化学法检测，根据结果再确定是否进行基因种系突变的检测［19］。一项回顾性研究显示，免疫组织化学联合检测MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失的敏感度为77%～100%，特异性为98%～100%，与MSI检测相当［20］。另一项系统回顾研究表明，在结直肠癌患者中筛查Lynch综合征，MSI检测的敏感度为66.7%～100.0%，特异性为61.1%～92.5%。免疫组织化学法检测的敏感度为80.8%～100.0%，特异性为80.5%～91.9%。两种检测方法均可较好地用于Lynch综合征的筛查［19］。因此，免疫组织化学法检测可作为MMR缺失分析的首选筛选方法，达到初步筛选Lynch综合征患者的目的［20］。

综上所述，MMR蛋白检测的应用，为结直肠癌患者及时筛查发现、治疗及随访Lynch综合征相关恶性肿瘤提供了简便有效的方法，由此可降低患癌的风险，不断提高人类健康水平。