转移性肾癌中PD-1与Treg的表达及其预后预测价值*

姚家喜 秦玉洁 单永玮 魏小义 牛世杰 胡骁轶 郭剑明

肾细胞癌约占人类恶性肿瘤的3%，转移性肾癌（metastatic renal cell carcinoma，mRCC）的5年生存率低于10%［1］。以酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase in⁃hibitors，TKI）为代表的靶向药物出现为mRCC患者的治疗带来新的选择，但最终仍有部分患者因耐药导致疾病进展直至死亡［2］。因此，对于mRCC的新型治疗方法的研究从未停止，其中有针对性的免疫治疗效果显著［3］。程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1，PD-1）广泛表达于人体内各种细胞中，主要在肿瘤浸润性细胞毒性淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）中表达，与肿瘤细胞表面的程序性死亡受体配体1（programmed cell death protein-ligand 1，PD-L1）结合，起到调控T细胞活性、抑制T细胞对肿瘤的杀伤作用［4］。因此，PD-1阳性淋巴细胞可能参与肿瘤细胞的免疫逃避。但在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中，免疫组织化学法检测并未证实ccRCC组织中的PD-1表达与临床预后相关［5］。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一群免疫细胞，可以抑制自身免疫反应及抑制自身CTL的抗肿瘤效应［6］。研究显示，肿瘤内浸润的Treg细胞数量与弥漫性大B细胞淋巴瘤预后不良有关［7］。本研究旨在评估肿瘤内浸润的PD-1阳性淋巴细胞及Treg细胞与行TKI治疗的mRCC患者的临床病理资料及预后的关系，为临床治疗mRCC的预后判断提供帮助。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2007年6月至2017年6月269例复旦大学附属中山医院mRCC患者的临床病理资料，其中男性195例、女性74例，年龄为14～87岁，中位年龄为57岁。术后病理或穿刺活检均证实转移，转移部位为肺脏、骨、肝脏、脑等，切除的原发病灶标本用于本研究。对病例均重新进行TNM分期评估，根据国际泌尿病理协会（ISUP）对Fuhrman分级重新定义［8-9］。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会批准与患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测 免疫组织化学法检测mRCC患者组织中的PD-1和Treg表达。于EDTA缓冲液中使用高压抗原修复方法处理组织切片10 min。FoxP3（检测Treg细胞）和PD-1抗体均购自艾博抗上海贸易有限公司，稀释比例为1:100，一抗4℃孵育过夜，37℃温箱孵育二抗，DAB显色、苏木精复染。

1.2.2 结果判断 评估每例肿瘤浸润的Treg细胞和PD-1阳性细胞的数量。PD-1阳性细胞主要为肿瘤间质淋巴细胞，先观察整张切片（×100倍），随后随机选择5个高倍视野（×400倍），求其平均值作为该病例PD-1阳性细胞数。根据PD-1阳性细胞在肿瘤组织中分布的多少分为阳性、阴性表达组。Treg细胞以同样方法进行计数，分为高表达、低表达组。

1.2.3 随访 所有患者均有完整的随访资料，随访截至2017年6月。总生存（overall survival，OS）期的计算从手术日期至随访截止日期，或死亡日期；无进展生存（progression-free survival，PFS）期的计算从手术日期至随访截止日期，或疾病进展日期。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料不同组间比较采用t检验，计数资料不同组间比较采用χ2检验，生存率的组间比较采用Kaplan-Meier生存曲线法及Log-rank检验。单因素和多因素Cox比例风险回归分析进行评估Treg和PD-1与生存的关系。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1和Treg与mRCC患者临床病理特征的关系

PD-1主要在细胞的细胞膜及细胞质中表达，Treg细胞主要在肿瘤间质中散在分布（图1）。269例mRCC患者组织中PD-1阳性表达为85例，Treg高表达为99例。PD-1阳性表达与患者Fuhrman分级相关（P=0.004），Treg高表达与患者性别（P=0.004）、Fuhrman分级（P=0.011）显著相关（表1）。

图1 免疫组织化学法检测mRCC患者组织中PD-1和Treg表达（DAB染色×200）

2.2 PD-1和Treg与mRCC患者术后生存的关系

269例mRCC患者的Kaplan-Meier生存分析显示，mRCC患者组织中PD-1和Treg浸润的数量与患者生存相关，PD-1阳性与Treg高表达患者的OS（P=0.017 9与P=0.005 4）及PFS（P=0.019 2与P=0.044 2）更低（图2）。PD-1联合Treg（PD-1/Treg）评估mRCC患者的预后显示，PD-1阳性/Treg高表达的患者的中位OS及PFS分别为23.5、10.0个月，预后最差；PD-1阴性/Treg低表达患者的中位OS及PFS分别为51.0、21.0个月，预后最佳（图3）。

2.3 mRCC患者与PD-1和Treg表达关系的单因素和多因素Cox比例风险回归分析

单因素分析显示，Treg、PD-1、TNM分期、Fuhrman分级、肺转移、IMDC与OS显著相关；Treg、PD-1、TNM分期、性别、肺转移、IMDC与PFS显著相关。将上述单因素有意义变量纳入多因素Cox比例风险回归分析，TNM分期、肺转移、IMDC和PD-1/Treg是mRCC患者OS的独立预后因素；TNM分期、IMDC和PD-1/Treg是mRCC患者PFS的独立预后因素。PD-1阳性/Treg高表达患者的OS相对危险度上升2.474倍（P=0.001），PFS相对危险度上升2.065倍（P=0.002），见表2。

表1 269例患者临床病理特征与PD-1和Treg表达的关系

表1 269例患者临床病理特征与PD-1和Treg表达的关系（续表1）

图2 mRCC患者术后OS和PFS与PD-1和Treg表达的关系

图3 mRCC患者术后OS和PFS与PD-1/Treg表达的关系

表2 多因素Cox比例风险回归分析各指标与mRCC患者OS及PFS之间的关系

3 讨论

本研究发现，肿瘤内浸润性PD-1及Treg对mRCC预后有独立预测作用。PD-1表达和Treg细胞浸润数量是mRCC患者OS和PFS的独立预测因子，提示PD-1/Treg可作为mRCC患者的预后指标。纳武单抗（nivolumab）与依维莫司对比的临床试验数据分析显示，在既往使用舒尼替尼的患者中，二线治疗使用nivolumab与依维莫司的中位OS分别为23.6、19.8个月；既往使用帕唑帕尼的患者中，二线治疗使用nivolumab与依维莫司的中位PFS分别为15.6、11.7个月［10-11］。因此，相比TKI靶向药物，PD-1靶向免疫治疗可能具有更好的应用价值及疗效，免疫治疗在mRCC中显示出巨大潜力。

本研究发现，PD-1及Treg均与mRCC不良预后指标（Fuhrman分级）显著相关，生存分析显示Treg高表达预示mRCC的OS和PFS较短。Whiteside等［12］研究表明，肿瘤内浸润性Treg高表达与各种恶性肿瘤的预后不良有关。该研究发现，肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）患者外周血中Treg细胞数量高于健康人，治愈性切除肿瘤后，外周血中Treg细胞数量降至正常水平。同时该研究表明，肿瘤相关因子可能参与Treg的浸润聚集，但Treg如何参与调节肿瘤微环境的确切机制尚未明确。Treg相关免疫抑制功能可能通过阻断T细胞和抗原呈递细胞的功能来介导。Kim等［5］采用免疫组织化学法对ccRCC患者组织中的PD-1进行检测，并未发现与临床预后相关，可能与研究对象为非mRCC有关，且病例数相对较少。因此本研究针对mRCC组织中的PD-1及Treg表达进行检测，并对其与OS及PFS的关系进行分析，发现Treg浸润与PD-1阳性细胞的浸润显著相关（P＜0.001），56.5%（48/85）PD-1阳性患者同时存在Treg高表达。本研究结果表明，PD-1与Treg介导的免疫抑制显著相关，PD-1的阻断和Treg的功能抑制可能是mRCC免疫治疗的一种可选治疗方法。因此，评估mRCC患者组织中PD-1和Treg有助于对预后不良进行判断，以利于尽早干预治疗。mRCC的治疗正发生日新月异的变化，随着近几年多种药物通过FDA批准快速上市，以及免疫治疗兴起，以nivolumab和派姆单抗（pembrolizumab）及伊匹单抗（ipilimumab）为代表的免疫治疗药物在恶性肿瘤患者中广泛应用。nivolumab已被批准用于TKI治疗失败后的二线治疗，以及联合ipilimumab治疗先前未行药物治疗的中高危的晚期RCC患者。正在开展的临床试验可能会加快一线治疗中nivolumab单药的使用，或联合TKI药物治疗的审批早日通过。

综上所述，本研究表明mRCC肿瘤内PD-1及Treg浸润为不良预后指标，PD-1阳性/Treg高表达患者的OS及PFS较PD-1阴性/Treg低表达者差，对预测mRCC的预后具有良好价值。因此，评估mRCC患者肿瘤组织中PD-1表达和Treg细胞的浸润有助于选择合适患者进行有效的免疫治疗，尽早对临床上预后不良的患者进行早期干预治疗。