地西他滨联合三氧化二砷对肝癌SMMC-7721细胞株P15INK4B 及甲基化转移酶表达的影响

边祥海 孙贵富

肝癌恶性程度较高，预后较差，死亡率高，提高肝癌治愈率及生存期是肝癌研究的重点和难点。研究[1-2]证实，肝癌的发生与相关基因甲基化有关，正常肝脏、肝硬化、肝癌组织中，肿瘤抑制基因甲基化程度呈逐渐增强态势，且差异明显。地西他滨是第一个被美国食品药品监督管理局批准的用于治疗骨髓增生异常综合征表观遗传学的去甲基化药物，可以抑制甲基化转移酶，激活沉默的抑癌基因[3]。三氧化二砷具有诱导肿瘤细胞分化，促进凋亡及细胞毒作用，小剂量联合用药有望成为肝癌治疗的新出路[4-5]。本研究主要探讨两药对肝癌SMMC-7721细胞株P15抑癌基因及甲基化转移酶的表达影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 肝癌SMMC-7721细胞株引自中科院上海细胞生物研究所；地西他滨注射液（decitabine，DAC，山东鲁南制药集团，批号098150301，规格50mg/瓶）；三氧化二砷注射液（arsenic trioxide，As2O3，北京双鹭药业股份公司，批号20130304，规格10mg/瓶）；四甲基偶氮唑盐购于美国Sigma公司（批号M2128）；M-MLV试剂盒购于上海Sangon公司（批号RP1100-50T）。

1.2 细胞培养 SMMC-7721细胞株用含10%热灭活胎牛血清（56℃，灭活30min）的RPMI 1640培养基，置37℃、5%的CO2培养箱中常规培养。每2～3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测各组对肝癌SMMC-7721细胞株的生长抑制率 取对数生长期细胞接种于96孔板，调整密度为 1×104/mL，每孔接种 200μL，DAC 药物组调整工作浓度分别为 1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L，As2O3组工作浓度分别为 1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L，联合用药组工作浓度为DAC2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L，空白对照组加入等体积的RPMI 1640培养液和等量的SMMC-7721细胞悬液，每个浓度设5个复孔。分别培养24、48、72h后加入20μL的 MTT（5mg/mL），继续孵育 4h，离心弃上清，加入DMSO 200μL/孔，上微型混合器震荡 20min，使结晶完全溶解。酶标仪测570nm处吸光度OD值。细胞增殖抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

1.4 RT-PCR检测P15INK4B、DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferases，DNMT1）、DNMT3A、DN MT3B 的mRNA的表达 收集1.3下药物处理细胞，每组约2×106个细胞，按Trizol法提取细胞mRNA，配制模板RNA/引物混合液，DNA按试剂盒要求逆转录合成cDNA，基因引物由上海生工基因公司合成：β-actin：上游 5′-CTAATAAGAAAAAGATCAACT-3′; 下游5′-AATCTTTGAAAATATTATTGC-3′（扩增产物 497 bp）；P15INK4B：上游 5′-TGGGGGCGGCAGCGATGA G-3′；下游 5′-AG-GTGGGTGGGGGTGGGAAAT-3′（扩增产物 450bp）；DNMT1：上游 5′-ACCGCTTCTAC TTCCTCGAGGCCTA-3′；下游 5′-GTTGCAGTCCTCT GTGAACACTGTGG-3′（扩增产物335bp）；DNMT3A：上游 5′-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3；下游 5′-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3′（扩增产物 551bp）；DNMT3B：上游 5′-AATGTGAATCCAG CCAGGAAAGGC-3′；下游 5′-ACTGGATTACACTCC AGGAACCGT-3′（扩增产物 190bp）。PCR 体系包括：上下游引物各 1μL，Taq DNA合成酶混合型12.5μL，模板 DNA2μL，P15INK4B的 PCR 反应条件：94℃预变性 5min，94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 60s，βactin反应共25个循环，P15反应共30个循环，72℃延伸5min。DNA 甲基转移酶 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的 25μL；PCR体系包括∶逆转录反应产物2μL，上游及下游引物各1μL，Taq DNA 合成酶混合型 12.5μL；反应参数为：94℃预变性 5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s，DNMT1、DNMT3A 反应共 30 个循环，DNMT3B反应共35个循环，72℃延伸5min。取反应产物 5μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳（1V/cm），凝胶成像系统（BIO-RAD公司）记录，ImageJ软件分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料采用均数+标准差（±s） 表示，多组比较用F检验，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞增殖抑制率比较 地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞具有生长抑制作用,具有剂量和时间依赖性，联合组优于地西他滨和As2O3单药组（P＜0.05），见表1。

表1 地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞增殖抑制率比较（%，±s）

表1 地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞增殖抑制率比较（%，±s）

注：DAC：地西他滨；As2O3：三氧化二砷；联合组：DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L

组别空白组DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L联合组孔数5 5 5 5 5 5 5 5 F-24h 0 5.2±0.3 16.4±0.6 30.7±0.6 9.7±0.5 33.2±0.5 34.3±0.6 55.8±0.8 9.277＜0.05 48h 0 11.2±0.4 19.1±0.4 22.6±0.4 12.8±1.3 37.5±0.5 38.2±0.3 57.1±3.7 11.317＜0.05 72h 0 15.6±1.1 24.1±0.7 33.8±0.7 14.9±0.8 45.5±1.2 47.9±2.5 69.9±1.2 15.287＜0.05 P-10.314 9.334 13.302 12.368 7.685 9.012 8.525＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 F P

2.2 地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞P15INK4B基因表达的影响 肝癌SMMC-7721细胞株的P15INK4B基因不表达或弱表达，经地西他滨和（或）As2O3作用72h后P15INK4B基因表达增强，具有剂量依赖性，联合组较单药组比较表达明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表2 地西他滨和（或）三氧化二砷对SMMC-7721细胞P15INK4B基因表达的影响（±s）

表2 地西他滨和（或）三氧化二砷对SMMC-7721细胞P15INK4B基因表达的影响（±s）

注：DAC：地西他滨；As2O3：三氧化二砷；联合组：DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L

组别空白组As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L联合组孔数5 5 5 5 5 5 5 5 F P灰度值0.38±0.16 0.34±0.12 0.43±0.14 0.56±0.11 0.33±0.14 0.44±0.19 0.57±0.15 0.74±0.14 22.313＜0.05

2.3 地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞甲基化转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表达的影响 经地西他滨和（或）As2O3作用72h后，SMMC-7721细胞甲基转移酶 DNMT3B、DNMT3A和DNMT1mRNA水平下降，具有剂量依赖性，联合组与单药组比较表达水平下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表3 地西他滨和（或）三氧化二砷对SMMC-7721细胞甲基转移酶的影响（±s）

表3 地西他滨和（或）三氧化二砷对SMMC-7721细胞甲基转移酶的影响（±s）

注：DAC：地西他滨；As2O3：三氧化二砷；联合组：DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L

组别空白组As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L联合组孔数5 5 5 5 5 5 5 5 F P DNMT3A 0.76±0.12 0.68±0.11 0.58±0.14 0.41±0.13 0.64±0.14 0.50±0.15 0.36±0.13 0.28±0.11 11.297＜0.05 DNMT3B 0.75±0.16 0.67±0.13 0.57±0.15 0.45±0.16 0.67±0.15 0.54±0.14 0.39±0.12 0.32±0.13 16.300＜0.05 DNMT1 0.77±0.16 0.69±0.12 0.58±0.16 0.44±0.12 0.65±0.14 0.59±0.14 0.44±0.19 0.31±0.15 17.453＜0.05

3 讨论

研究[1-2]证实肝癌的发生与DNA甲基化具有密切关系。在肝癌中，CpG岛的启动子高甲基化与抑癌基因沉默、转录抑制相关[6]。地西他滨通过抑制DNA甲基转移酶，减少DNA的甲基化，从而抑制肿瘤细胞增殖[7]。樊伍峰等[8]研究发现，地西他滨联合丙戊酸钠可以通过激活MEK/ERK信号转导通路抑制肝癌细胞HepG2的增殖。三氧化二砷为中药砒霜的主要成分，我国学者首创其用于治疗急性早幼粒细胞白血病，取得重大突破[4]，研究[9]表明其对肝癌具有一定的治疗作用。2011年9月卫生部医政司颁布的《原发性肝癌诊疗规范》中明确指出亚砷酸注射液为第一个经多中心临床研究证明有效而获国家食品药品监管局批准用于肝癌治疗的系统性化疗药物。孟真等[10]研究发现，三氧化二砷具有去甲基化作用。彭土生等[11]发现三氧化二砷能抑制肝HepG2细胞的黏附、迁移和侵袭能力。李海燕等[12]发现三氧化二砷能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力，机制可能与甲基化有关。郝立晓等[13]综述了近年来三氧化二砷联合药物治疗肝癌方面的最新进展，发现三氧化二砷药物联合治疗肝癌疗效确切。

本研究显示，地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞具有生长抑制作用，具有浓度和时间依赖性（P＜0.05）。本研究预实验显示，地西他滨在 1.0～4.0mmol/L浓度范围之间，三氧化二砷在1.0～4.0μmol/L浓度范围之间对肝癌SMMC-7721细胞株有较理想的增殖抑制作用，呈一定的时间、剂量依赖关系（P＜0.05）。为实现低毒高效的抗肝癌细胞目的，根据等效半量相加法的联合用药原则，笔者选取三氧化二砷和地西他滨的中间剂量组成联合组，同单用药比较，抑制率均比单用药高，差异有统计学意义（P＜0.05）。但是，两药联合的最佳剂量组合，仍待进一步的研究。

研究[14]证实，肝癌中的肿瘤抑制基因与启动子的高甲基化状态有关，而这些基因在调节细胞周期、凋亡、黏附、侵袭及DNA修复中具有关键作用。周期依赖激酶抑制基因P15通常被认为是肝癌错乱甲基化的靶点之一，INK4B基因表达P15蛋白，该蛋白质是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制性调节蛋白[15]。在许多组织中都有表达，其主要功能是通过与细胞周期依赖激酶结合，使细胞周期阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖。DNMT1是最先被克隆的特异DNA甲基转移酶，正常组织可呈持续低表达，其在维持基因甲基化状态中起重要作用。DNMT3A和DNMT3B是近来被克隆的另两种形式的甲基转移酶，正常组织中不表达或低表达，两者只对CpG位点甲基化修饰，是CpG位点胞嘧啶特异的DNA重新甲基转移酶[16]。甲基转移酶的异常激活，尤其是甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B的异常激活，可能导致肝癌细胞某些功能基因的启动子高度甲基化，进而可能引起包括P15INK4B基因在内的多种功能基因表达失活。彭建新等[17]研究发现，肝癌组织 DNMT1、3A、3BmRNA 显著高于其在癌旁组组织/肝硬化组织和慢性肝炎组织中的表达。我们对肝癌细胞株SMMC-7721的体外研究发现，经地西他滨和（或）As2O3作用72h后，P15INK4B基因表达增强，联合组较单药组表达明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；甲基化转移酶DNMT3Bm－RNA、DNMT3A和DNMT1mRNA的水平下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；地西他滨联合三氧化二砷同单药比较差异有统计学意义。

综上所述，地西他滨和三氧化二砷对肝癌SMMC-7721细胞株有增殖抑制作用，并可抑制甲基化转移酶，增加P15INK4B抑癌基因表达，两药联合具有协同性。