益气补肾方对自然流产模型小鼠母-胎界面Foxp3、RORγt、TGF-β及TNF-α蛋白表达研究

胡蓝雅文 叶 平，2 叶 骞 王欢欢 王百苗 董盼攀

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指与同一性伴侣连续发生≥2次于孕龄为20孕周之前的妊娠物或胎儿丢失（体质量＜500g）[1]。该病病因复杂，涉及生殖道感染、生殖道解剖结构异常、染色体异常、内分泌异常、血栓前状态、免疫紊乱等多种因素。文献[2]报道，约50%～60%的复发性流产问题与免疫紊乱有关。调节性T细胞（Treg）与辅助性T细胞 17（Th17）是“抑制/促炎”免疫细胞对，两者失衡可引起免疫耐受异常[3]。Foxp3是Treg细胞的特异性转录调节因子，在Treg细胞的胸腺内发育、外周分布及免疫抑制功能维持等方面具有重要作用。RORγt是Th17的特异性转录调节因子，在抵抗胞外菌感染、介导、炎症及自身免疫病、肿瘤等过程中发挥重要作用[4]。研究[5]发现，Foxp3 表达受抑制或者RORγt过度表达时，会导致Treg/Th17表达失衡，导致病理妊娠的发生。此外，Th17/Treg在细胞分化上关系密切，转化生长因子-β（TGF-β）为低浓度水平时，幼稚T细胞分化为Th17细胞，TGF-β高浓度水平，诱导幼稚T细胞分化为Treg细胞[6-7]。Treg还可释放TGF-β发挥免疫抑制作用，维持体内免疫耐受，有利于正常妊娠的维持。Th17细胞选择性产生炎性细胞因子并诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）产生；TNF-α 能激活中性粒细胞进入母胎界面组织，最终导致流产[8]。本研究采用自然流产模型小鼠，观察益气补肾方对自然流产模型小鼠母-胎界面 Foxp3、RORγt、TGF-β 及TNF-α蛋白表达的影响，为益气补肾方通过调节Th17/Treg平衡，防治复发性流产提供理论依据。

1 实验动物与试剂

1.1 动 物 SPF级雌性CBA/J小鼠36只、雄性DBA/2小鼠15只、雄性BALB/c小鼠3只，体质量（20±2）g。雄性DBA/2小鼠购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司 [合格证号：SCXK（沪）2013-0016]，雌性CBA/J、雄性BALB/c小鼠购于北京华阜康生物股份有限公司 [合格证号：SCXK（京）2009-0004]。

1.2 药 物 益气补肾方组成：黄芪36g，菟丝子30g，白术 18g，当归 6g，党参、陈皮、升麻、柴胡各12g，中药饮片购于华东医药股份有限公司。制备：用8倍水浸泡，过夜，先煮沸30min，倒出药液，再加入8倍水，煮沸20min，最后再加5倍水，煮沸20min，合并药液并减压浓缩，最后配制成益气补肾方煎剂（含生药 1.6g/mL），置-20℃冰箱备用。环孢素（CsA）溶液制备：灌胃前2h，将1粒CsA胶囊（诺华制药，批号S0340A；规格：25mg/粒）放入装有25mL 0.1%浓度甲醇溶液 [将0.1mL的无水甲醇溶于99.9mL的蒸馏水（避光保存）]的小烧杯中，待胶囊软化后，用针头将其刺破，使内容物充分溶解于甲醇溶液，待用。

1.3 试 剂 兔抗鼠多克隆抗体Foxp3（Cell Signaling，批号 2565）；抗 β-Actin兔多克隆抗体（Sigma公司，批号87420416）；抗人/鼠纯化抗体RORγt（affymetrix，批号 14-6988）；RIPA 裂解液（北京康为试剂生物科技有限公司，批号00041411）；Marker（美国 Thermo Scientific，批号 00222891）；TEMED（北京康为试剂生物科技有限公司，批号0614H）；30%Acr-Bis（北京康为试剂生物科技有限公司，批号0061410）；SDS-PAGE上样缓冲液（北京康为试剂生物科技有限公司，批号CW0028A）；兔抗人多克隆抗体 TNF-α（美国 NOVUS，批号 H6-NB600-587）；兔抗人多克隆抗体TGF-β（美国NOVUS，批号H6-NBP1-67698）；HRP Polymer Conjugate（美国 Invitrogen，批号 1639685A）；DAB 显色液（中杉金桥，批号101095D）。

1.4 仪 器 5417R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BCD-208A/D冷藏冷冻箱（中国海尔集团）；IEF双向电泳系统（美国Bio-Rad公司）；化学发光凝胶成像仪（美国Aplegen公司）；MF-501数字显微摄像系统（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 本实验采用Clark DA等[9]建立的经典自然流产模型小鼠，将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠2∶1合笼，建立正常妊娠模型，CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2∶1合笼，建立自然流产模型。每天17∶30～18∶00 合笼，早上 8∶00～8∶30 检查阴栓，见阴栓日为妊娠第0天；未见阴栓，则继续合笼。每日测量孕鼠体质量，观察腹部是否有明显隆起并及时排除假孕现象。最终得到正常妊娠模型孕鼠6只，作为正常妊娠模型组；自然流产模型孕鼠30只随机分为自然流产模型组、环孢素组、益气补肾高、中、低剂量组，每组6只。正常妊娠模型组和自然流产模型组小鼠给予0.9%生理盐水10mL/kg；环孢素组小鼠给予CsA溶液10mL/kg；益气补肾高、中、低剂量组分别给予12、24、48g/kg益气补肾方，连续14天，每天1次。

2.2 胚胎吸收率 末次给药取血完毕后，迅速处死小鼠进行解剖，取出胎盘及蜕膜组织，-80℃保存。用镊子撕开子宫，记录被吸收胚胎数和存活胚胎数。按下列公式计算胚胎吸收率：R=Re/（Re+F）×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎数，F表示存活胚胎数）。

2.3 Western-blot法检测母-胎界面组织Foxp3、RORγt蛋白表达 取-80℃保存的胎盘及蜕膜组织，经冰冷的0.01mol/L PBS充分洗涤后置入玻璃匀浆器中，然后加入预冷的蛋白裂解液研磨成匀浆，4℃ 12 000r/min离心30min，取上清液。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒，每个泳道上样100μg。70V电泳1h，分离胶120V电泳2h；然后120V恒压电转2h至PVDF膜。5%脱脂奶粉37℃封闭2h。一抗4℃过夜，二抗（1∶5000稀释）37℃ 2h。TBST洗膜3次，每次10min，凝胶成像系统对膜上蛋白条带进行采集和分析。

2.4 免疫组化法检测母-胎界面组织中TGF-β、TNF-α蛋白表达 取胎盘及蜕膜组织，浸泡于10%福尔马林溶液固定，再先后行脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制备组织蜡块；然后经切片—脱蜡及水化—高压热修复—3%H2O2溶液阻断—加抗体（TGF-β、TNF-α抗体浓度均为1∶100）—加生物素化山羊抗小鼠IgG（兔）—DAB显色—苏木素复染—盐酸酒精分化、返蓝—梯度乙醇脱水—二甲苯透明—中性树胶封片。显微镜观察TGF-β、TNF-α表达阳性表达，用ImageProPlus软件计算平均光密度值。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，多个样本均数比较采用方差分析，组间方差分析用F检验，有差异的组间两两比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠胚胎吸收率比较 与正常妊娠模型组比较，自然流产模型组胚胎吸收率显著升高（P＜0.05）；连续给药14天，与自然流产模型组比较，环孢素组及益气补肾各剂量组胚胎吸收率均明显降低（P＜0.05）；益气补肾各剂量组与环孢素组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；益气补肾各剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

表1 各组小鼠胚胎吸收率比较（只，±s）

表1 各组小鼠胚胎吸收率比较（只，±s）

注：与正常妊娠模型组比较，△P＜0.05；与自然流产模型组比较，*P＜0.05

组别正常妊娠模型组自然流产模型组环孢素组益气补肾低剂量组益气补肾中剂量组益气补肾高剂量组鼠数6 6 6 6 6 6总胚胎数39 40 42 42 36 38吸收胚胎数4 10 5 6 4 5每只存活胚胎数6.5±2.2 6.7±0.8 7.0±1.3 7.0±0.6 6.0±1.7 6.3±1.0胚胎吸收率（%）10.3*25.0△11.9*14.3*11.1*13.2*

3.2 各组小鼠母-胎界面组织Foxp3、RORγt蛋白表达比较 与正常妊娠模型组比较，自然流产模型组Foxp3蛋白表达显著降低、RORγt蛋白表达显著升高（P＜0.05）。连续给药14天，与自然流产模型组比较，益气补肾中、高剂量组小鼠Foxp3蛋白表达显著升高，RORγt蛋白表达显著降低（P＜0.05），益气补肾中、高剂量组与环孢素组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2、封二图 1。

表2 各组小鼠母胎界面组织Foxp3、RORγt蛋白表达量比较（±s）

表2 各组小鼠母胎界面组织Foxp3、RORγt蛋白表达量比较（±s）

注：与正常妊娠模型组比较，△P＜0.05；与自然流产模型组比较，*P＜0.05；Foxp3：叉头翼状螺旋转录因子3；RORγt：维甲酸相关核孤儿受体γt

组别正常妊娠模型组自然流产模型组环孢素组益气补肾低剂量组益气补肾中剂量组益气补肾高剂量组鼠数 剂量（g/kg）6 6 6 6 6 6--0.0025 12 24 48 Foxp3 1.407±0.101 0.700±0.147△1.223±0.240*0.873±0.097 1.220±0.241*1.383±0.216*RORγt 0.643±0.112 1.456±0.165△0.950±0.246*1.180±0.182 0.897±0.321*0.670±0.082*

3.3 各组小鼠母-胎界面组织TGF-β、TNF-α蛋白表达比较 与正常妊娠模型组比较，自然流产模型组小鼠胎盘组织TGF-β表达显著降低（P＜0.05）；TNF-α 表达显著降升高（P＜0.05）。连续给药 14天，与自然流产模型组比较，益气补肾方各剂量组TNF-α 表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGF-β 表达均显著升高（P＜0.05），见表 3、封二图 2、封三图 3。

4 讨论

复发性流产属中医“滑胎”范畴。凡是堕胎或者小产连续发生3次或3次以上者，称为“滑胎”，也称为“数堕胎”、“屡孕屡堕”,在已婚妇女中发病率为1%～3%[10]，是常见的妊娠病之一。中医认为，滑胎的病机主要有肾虚、脾虚、气虚、血虚、血热、气血两虚、血瘀等，肾虚和脾虚是滑胎的主要病机，以肾虚最为关键。肾主先天，肾虚则冲任不固；脾主后天，脾虚则胎失所养，遂致“胎漏”、“胎动不安”、“堕胎”、“小产”、“滑胎”等。益气补肾方以李东垣《脾胃论》中的补中益气汤为主方进行加减，该方重用黄芪、菟丝子为君药，黄芪性味甘温，归肺脾经，具有补中益气、升阳固表之效；菟丝子性味甘平，入肝肾脾经，补益肝肾，填精益髓而安胎。

表3 各组小鼠母胎界面组织TNF-β、TGF-α表达量比较（±s）

表3 各组小鼠母胎界面组织TNF-β、TGF-α表达量比较（±s）

注：与正常妊娠模型组比较，△P＜0.05；与自然流产模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；TNF-β：肿瘤坏死因子-β；TGF-α：转化生长因子-α

组别正常妊娠模型组自然流产模型组环孢素组益气补肾低剂量组益气补肾中剂量组益气补肾高剂量组鼠数6 6 6 6 6 6 TGF-β 0.084±0.033 0.033±0.015△0.102±0.046*0.112±0.030*0.090±0.010*0.093±0.014*TNF-α 0.051±0.018 0.074±0.013△0.030±0.003**0.033±0.011**0.049±0.025*0.049±0.021*

研究[11]发现，复发性流产产生因素很多，免疫失调为重要因素，一般认为正常妊娠中胚胎作为同种异体移植物，有赖于母体对胚胎的免疫耐受，一旦免疫耐受被打破，母体对胚胎产生免疫排斥，则会导致流产的发生。本研究前期临床[12]和药理实验[13-14]表明，益气补肾方确有防治复发性流产的功效，初步研究发现其机制可能与调节免疫失衡有关[15]。

Treg与Th17是一对免疫“抑制/促炎”细胞对，其中CD4+CD25+Treg细胞具有免疫调节功能，在维持机体内环境稳定，诱导移植耐受以及自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用[16]。临床和实验研究[17]证实，调节性T细胞和Th17细胞在母-胎界面免疫耐受中起着重要作用。CD4+CD25+Treg细胞可使蜕膜环境呈免疫耐受状态而维持妊娠。转录因子Foxp3是X染色体上基因编码的叉头样转录因子家庭成员，作为CD4+CD25+的转录调控因子，起着调节性T细胞（Treg）发育和功能维持的重要作用，它通过直接调控多种基因来调节Treg的活性[18]。Foxp3表达的下降会导致调节性T细胞的下降，而Foxp3蛋白的过表达也会引起复杂的免疫抑制[19]；Foxp3缺陷的小鼠不能形成CD4+CD25+Treg，并同时患有炎性疾病和自身免疫性疾病，传输正常的CD4+CD25+T细胞后可以阻止炎性疾病的发生[20]。维甲酸相关孤核受体家族中RORγt和RORα是控制Th17细胞分化的关键转录因子[21]，二者共同介导Th17细胞的分化。刘长明等[22]研究发现，Th17的转录因子RORγt在复发性流产患者外周血及蜕膜中高度表达，当同时敲除RORγt和RORα后可以完全阻断Th17的分化，而缺失任何一个都只能部分抑制Th17细胞因子的表达。

TGF-β是Treg/Th17分化发育的促动因子，具有调节细胞生长、分化和免疫的功能，还能促进子宫内膜的蜕膜化过程。研究[23]发现，TGF-β广泛参与了蜕膜浸润，在子宫内膜大量表达，在妊娠维持中起重要作用。党慧敏等[24]研究发现，复发性自然流产患者TGF-β明显低于正常妊娠组。Th17可选择性地产生炎症性细胞因子IL-17，进而诱导IL-6、IL-23、肿瘤坏死因子等多种因子的表达[25-26]。而TNF-α是重要的免疫调节因子和炎症因子，具有重要的生物学功能，它广泛存在于女性生殖道、闭锁卵泡、胚胎、胎盘和黄体细胞等。生理情况下，适量TNF-α可促进滋养层细胞的增殖、分化和凋亡，促进绒毛促性腺激素和孕激素的合成，有利于妊娠的维持[21]。病理情况下，过量的TNF-α反而会抑制黄体功能，引起孕激素的降低导致流产[27]。高浓度的TNF-α具有促进溶解坏死和凋亡的作用，提高子宫平滑肌的兴奋性，排除胎盘组织，激活凝血系统，引起血栓从而导致流产[28]。

本研究显示，益气补肾方可明显促进模型小鼠TGF-β 阳性表达（P＜0.05），抑制母胎界面组织TNF-α 表达（P＜0.05，P＜0.01），提示该方可能通过调节TGF-β，促进祖细胞向Treg方向分化、减少Th17方向分化；Western-blot检测发现益气补肾方可以促进转录因子 Foxp3表达（P＜0.05）、抑制RORγt表达（P＜0.05），提示其可通过调节Treg/Th17相关转录因子表达，从而调节免疫平衡。综上说明，益气补肾方通过调节Treg/Th17分化、生成，使免疫平衡向Treg细胞方向移动，从而维持免疫耐受，防治复发性流产。