土地海苓煎颗粒质量标准研究

白 妮，张红梅，刘 杰

(1.延安市中医医院，延安 716000；2.延安市疾病预防控制中心，延安 716000)

土地海苓煎颗粒为延安市中医医院制剂室按照经验方独家生产品种，批准文号为陕药管制字[2001]第3694号。原方由黄芩、知母、猪苓及枳实等12味中药组成；临床主治湿热下注所致之小便淋漓、灼热、涩痛或尿频尿急、小腹胀满、腰困腰痛等症。

土地海苓煎颗粒现行质量标准鉴别项仅有黄芩苷的TLC鉴别，专属性不强，为完善该制剂的质量控制标准、提高患者用药安全性，笔者对方中主要药效成分进行了TLC鉴别，最终选取了3种分离度较好、斑点清晰、重复性好的成分列入质量标准。参考有关文献[1-18]，在大量实验的基础上，首次采用双波长法同时测定土地海苓煎颗粒中芒果苷和辛弗林的含量，作为本制剂的定量指标。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-20AT岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；超声波清洗器(上海安宁科学仪器公司)；TG328B分析天平(上海精科天平有限公司，精密度0.1 mg)。

1.2试药 芒果苷对照品(批号131507-201402，质量分数99.6%)，辛弗林对照品(批号140716-201306，质量分数99.7%,中国食品药品检定研究院)；土地海苓煎颗粒(延安市中医医院，批号分别为：20161107，20161212，20170224，20170319，20170424，20170513，20170606，20170711，20170810和20170903，规格：12 g·袋-1)。

2 方法与结果

2.1TLC鉴别

2.1.1知母 取土地海苓煎颗粒48 g，研成细粉，加稀乙醇100 mL，超声处理30 min，取滤液，蒸干，加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。称取芒果苷对照品，用稀乙醇制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的对照品溶液；取缺知母的样品颗粒，按照供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各15 μL，点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-正丁醇-甲酸(3.5∶4∶5)为展开剂，展开，晾干，置于紫外光灯365 nm处检视[9]。供试品色谱中，在与对照色谱相应位置上，显相同的蓝色斑点。阴性样品无斑点。结果见图1A。

2.1.2猪苓 取土地海苓煎颗粒48 g，研成细粉，加甲醇80 mL，超声处理30 min，将滤液蒸干，用1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。称取麦角甾醇对照品，用甲醇制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的对照品溶液。取缺猪苓的样品颗粒，按照供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各20 μL，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(13∶1)为展开剂，展开，晾干，喷20 mL·L-1香草醛硫酸溶液，显色，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点。阴性样品无此斑点。结果见图1B。

2.1.3枳实 取土地海苓煎颗粒48 g，研成细粉，加甲醇80 mL，超声处理30 min，将滤液蒸干，用1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。称取辛弗林对照品，用甲醇制成质量浓度为2 mg·mL-1的对照品溶液。取缺枳实的样品颗粒，按照供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各20 μL，分别点于同一硅胶薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，以质量浓度为5 g·L-1的茚三酮乙醇液为显色剂，加热至斑点显色清晰。在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同紫红色的斑点。阴性样品无此斑点。结果见图1C。

图1TLC图

A:1.阴性样品；2～4.供试品；5.芒果苷对照品。B:1.阴性样品；2～4.供试品；5.麦角甾醇对照品。C:1.阴性样品；2～4.供试品；5.辛弗林对照品。

Fig.1 TLC chromatograms

A:1.negative sample；2-4.sample；5.mangiferin.B:1.negative sample;2-4.sample;5.ergosterol.C:1.negative sample;2-4.sample;5.synephrine.

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：岛津Shim-pack VP-ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(B)-水(A∶1 000 mL水中加入磷酸二氢钾0.6 g、十二烷基磺酸钠1.0 g和冰醋酸1.0 mL)，作梯度洗脱，0→30 min，50%B→80%B；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：258和285 nm；柱温：30 ℃；在上述色谱条件下，2种待测组分均达到了基线分离。理论塔板数以芒果苷和辛弗林计均≥6 000；分离度>1.5；进样量：10 μL。

2.2.2溶液的制备 对照品溶液：精密称取芒果苷和辛弗林对照品适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成质量浓度分别为150和750 mg·L-1的对照品溶液。

混合对照品溶液：精密称取芒果苷和辛弗林对照品适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成芒果苷和辛弗林质量浓度分别为150和750 mg·L-1的混合对照品溶液。

供试品溶液：精密称取土地海苓煎颗粒10.0 g，研细，置于50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，再加甲醇定容至刻度，过滤，即得。

阴性样品溶液：按照处方比例及制备工艺，分别制备缺知母和枳实的阴性样品，按照上述供试品溶液制备方法制得阴性样品。

2.2.3专属性实验 取2.2.2项下制备的对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱测定仪，记录色谱图，结果显示，阴性样品对测定无干扰。见图2。

图2HPLC图

A.芒果苷对照品(258 nm)；B.辛弗林对照品(285 nm)；C.供试品(258 nm)；D.供试品(285 nm)；E.缺知母阴性样品(258 nm)；F.缺枳实阴性样品(285 nm)；1.芒果苷；2.辛弗林。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mangiferin control (258 nm)；B.synephrine control (285 nm)；C.test sample (258 nm)；D.test sample (285 nm)；E.negative sample of missingAnemarrhenae(258 nm)；F.negative sample of missingFructusaurantiiimmaturus(285 nm)；1.mangiferin；2.synephrine.

2.2.4线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液，用甲醇倍比稀释，配制芒果苷质量浓度分别为150.0，75.0，37.5，18.8，9.4和4.7 mg·L-1的系列对照品溶液；辛弗林配成质量浓度分别为750.0，375.0，187.5，93.8和46.9 mg·L-1的系列对照品溶液，进样测定，记录色谱峰。以芒果苷、辛弗林的质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，进行回归分析，得芒果苷和辛弗林的线性方程分别为：y1=2.274 6x1-11.654(r1=0.999 9)和y2=0.443 2x2-3.109 7(r2=0.999 9)；芒果苷和辛弗林的线性范围分别为4.7～150.0和46.9～750.0 mg·L-1，与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5精密度实验 精密吸取芒果苷和辛弗林混合对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，芒果苷和辛弗林的峰面积RSD值分别为1.34%和1.14%。结果表明，所选仪器精密度良好。

2.2.6稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12和24 h进样，测定样品中芒果苷和辛弗林的峰面积，结果芒果苷和辛弗林的RSD值分别为2.36%和2.45%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7重复性实验 精密称取土地海苓煎颗粒10.102，10.113，10.245，10.018，10.124和10.112 g，按照2.2.2项下方法制备溶液，并按照2.2.1项下色谱条件进样测定。样品中芒果苷和辛弗林的平均含量(n=6)分别为0.058和2.418 mg·g-1；RSD值分别为1.56%和1.48%，结果表明，该方法重复性良好。

2.2.8回收率实验 取6份已知含量的土地海苓煎颗粒，加入2.2.2项下制备的对照品溶液适量，进行色谱分析，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

表1回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test (n=6)

2.2.9含量测定 取10个批次的土地海苓煎颗粒，按照2.2.2项下方法制备溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按照2.2.1项下色谱条件进行测定，用外标法计算样品中芒果苷和辛弗林的含量，结果见表2。

表2不同批次土地海苓煎颗粒中芒果苷和辛弗林的含量测定结果

Tab.2 Content determination of mangiferin and synephrine in Tudihailingjian granules from different batches

(n=10)

3 讨论

土地海苓煎颗粒的TLC鉴别中考察了不同极性组合的二元系统展开剂，最终确定的方法重复性和专属性较好，可快速、有效地对土地海苓煎颗粒质量进行控制。HPLC法对成分较复杂的中药具有良好的分离效果，且能有效提高样品的分析效率[10-18]。本实验采用HPLC法测定土地海苓煎颗粒中芒果苷和辛弗林的含量，结果表明，该法操作简便、重复性好，分离度好，分析时间短。

从土地海苓煎颗粒的紫外扫描图可知，辛弗林和芒果苷的最大吸收波长分别为285和258 nm，因此本实验采用二极管阵列检测器[19]，使用双波长法同时快速地对土地海苓煎颗粒中2种成分的含量进行测定。

本实验所建立的土地海苓煎颗粒质量标准TLC法专属性强，分离度好，斑点显色清晰；HPLC法分析时间短，准确度高，重复性好。较现行土地海苓煎颗粒质量标准有较大提高，可用于土地海苓煎颗粒的质量控制。