HPLC法同时测定小檗碱甲氧苄啶胶囊中2种组分的含量

于文萃，高毓涛，于凤斌

(1.辽宁地质工程职业学院，丹东 118000；2.丹东市药品检验检测中心，丹东 118002)

小檗碱甲氧苄啶胶囊为复方制剂，主要成分为盐酸小檗碱和甲氧苄啶，体外实验证实[1]，盐酸小檗碱对多种革兰氏阳性及阴性菌均有抑制作用，其中对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、志贺菌属、脑膜炎奈瑟菌、白喉杆菌和伤寒杆菌等的抑制作用较强。甲氧苄啶[2]干扰细菌叶酸代谢，选择性抑制二氢叶酸还原酶和核酸的合成。二者组成复方制剂的抗菌作用较单药增强，耐药菌株减少，临床用于敏感菌所致的胃肠炎和细菌性痢疾等肠道感染疾病。现行质量标准[3]对其组分盐酸小檗碱、甲氧苄啶分别采用HPLC法和紫外分光光度法进行含量测定，步骤繁琐，操作不便，样品消耗量大，为了提高检验效率，简化质量标准，本文参考相关文献[4-7]，首次利用HPLC法建立了同时测定小檗碱甲氧苄啶胶囊中盐酸小檗碱和甲氧苄啶含量的方法，该方法简便、快速、准确、重复性好。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津LC-10AT高效液相色谱系统，岛津SPD-10A(UV-Vis Detector)，岛津Labsolution 色谱工作站[岛津(中国)有限公司]；SK8200HP超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)；JJ500型精密电子天平(常熟双杰测试仪器厂)；XS-205十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2试药 盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212，质量分数86.7%)，甲氧苄啶对照品(批号100031-201606，质量分数99.8%)，均购自中国食品药品检定研究院；小檗碱甲氧苄啶胶囊(每粒含盐酸小檗碱100 mg，甲氧苄啶50 mg)为市售；磷酸二氢钾(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为自制去离子超纯水。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的制备 分别取盐酸小檗碱和甲氧苄啶对照品23.13和10.37 mg，置于同一100 mL量瓶中，用体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，取上述储备液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，用体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为40.11和20.70 μg·mL-1的盐酸小檗碱和甲氧苄啶的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，精密称取0.214 6 g(含盐酸小檗碱和甲氧苄啶100和50 mg)，置于250 mL量瓶中，用体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，置于100 mL量瓶中，用体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液稀释至刻度，即得。

2.3色谱条件及系统适用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(30∶70)为流动相；进样量为20 μL；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为270 nm。色谱图见图1。在该色谱条件下，理论塔板数分别按照盐酸小檗碱和甲氧苄啶峰计算均不低于5 000，分离度符合要求。

图1HPLC图

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性辅料溶液；1.甲氧苄啶；2.盐酸小檗碱。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution;B.sample solution;C.negative excipients solution；1.trimethoprim；2.berberine hydrochloride.

2.4方法学考察

2.4.1线性范围 精密量取2.1项下制备的对照品储备液5.0，10.0，15.0，20.0和25.0 mL，分别置于100 mL量瓶中，用体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制得系列对照品溶液。按照2.3项下色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)，绘制标准工作曲线，经回归分析，盐酸小檗碱质量浓度在10.026 9～50.134 3 μg·mL-1范围内有良好的线性关系，回归方程为：y1=9.324×104x1-1.051×104，r1=0.999 9；甲氧苄啶在5.174 6～25.873 2 μg·mL-1范围内有良好的线性关系，回归方程为:y2=2.467×104x2+3.960×103，r2=0.999 5。

2.4.2精密度实验 精密吸取同一对照品溶液20 μL，连续进样6次，记录色谱图，盐酸小檗碱和甲氧苄啶峰面积的RSD值分别为0.4%和0.6%(n=6)。

2.4.3稳定性实验 取10粒小檗碱甲氧苄啶胶囊内容物，研细，精密称取细粉，按照2.2项下方法进行制备，分别于0，2，4，8，12，16和24 h进行测定，记录色谱图，盐酸小檗碱和甲氧苄啶峰面积的RSD值分别为0.7%和0.5%(n=7)。

2.4.4重复性实验 精密称取同一批小檗碱甲氧苄啶胶囊内容物细粉6份，按照2.2项下方法进行制备，按照2.3项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按照外标法计算，结果盐酸小檗碱和甲氧苄啶的含量分别为标示量的96.8%和100.2%，RSD值分别为0.2%和0.5%(n=6)。

2.4.5加样回收率实验 精密称取已知含量(盐酸小檗碱96.3%，甲氧苄啶100.1%)的小檗碱甲氧苄啶胶囊(批号161203)细粉(含盐酸小檗碱100 mg，甲氧苄啶50 mg)6份，置于250 mL量瓶中，加体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液适量，使溶解并定量稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液2.5 mL，置于50 mL量瓶中，加入含盐酸小檗碱和甲氧苄啶质量浓度分别为200.54 和103.49 μg·mL-1的混合对照品溶液4.0，5.0和6.0 mL，各2份，加体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得加样回收样品溶液。按照2.3项下色谱条件进行测定，盐酸小檗碱的平均回收率为99.9%，RSD值为0.3%(n=6)，甲氧苄啶的平均回收率为99.5%，RSD值为0.8%(n=6)，见表1。

表1盐酸小檗碱和甲氧苄啶回收率测定结果

Tab.1 Determination results of recovery rate of berberine hydrochloride and trimethoprim

(n=6)

2.5含量测定 取2个厂家生产的小檗碱甲氧苄啶胶囊，每个厂家取3个批号，共计6个批次的药品，按照2.2项下方法配制供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进行测定，以外标法计算含量，结果见表2。

表2样品测定结果

Tab.2 Determination results of samples (n=3)

3 讨论

3.1方法的选择 小檗碱甲氧苄啶胶囊是由盐酸小檗碱和甲氧苄啶组成的复方制剂，临床药效强于二者单独使用，现行制剂的质量标准对2个组分分别进行质量控制，对甲氧苄啶采用紫外分光光度法进行含量控制，该步骤繁琐、操作不便，样品消耗量大，同时大量使用氯仿等对人体毒害较大的有机试剂。为了简化质量标准，避免氯仿等有毒试剂的大量使用，本文利用HPLC法建立同时测定小檗碱甲氧苄啶胶囊中盐酸小檗碱和甲氧苄啶含量的方法。

3.2溶剂的选择 实验中的溶剂同时考察了水，0.1 mol·L-1盐酸，体积分数为1%的盐酸甲醇溶液和体积分数为1%的盐酸和50%的甲醇溶液。其中水，0.1 mol·L-1盐酸和体积分数为1%的盐酸甲醇溶液均出现了样品中至少1种组分溶解不完全，而以体积分数1%的盐酸和50%的甲醇溶液为溶剂时，样品中2种组分完全溶解，同时液相系统中的溶剂峰对待测组分峰无干扰。

3.3测定波长的选择 根据盐酸小檗碱和甲氧苄啶的紫外吸收图谱，盐酸小檗碱在263 nm波长处有最大吸收，甲氧苄啶在270 nm波长处有最大吸收，综合考虑盐酸小檗碱和甲氧苄啶的紫外吸收特性，确定检测波长为270 nm。

3.4流动相的选择 参考相关研究[8-16]，流动相系统同时考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸盐缓冲液和甲醇-磷酸盐缓冲液系统，结果乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(30∶70)流动相系统可使盐酸小檗碱和甲氧苄啶达到完全分离，且峰形良好，流动相对待测组分的分离没有干扰。同时也考察了不同品牌的色谱柱，分离重复性良好。

本文首次建立HPLC法同时测定小檗碱甲氧苄啶胶囊中盐酸小檗碱和甲氧苄啶含量的方法，该方法操作简便、快速、准确、重复性好、取样量小，可用于小檗碱甲氧苄啶胶囊中盐酸小檗碱和甲氧苄啶2种组分的质量控制，为小檗碱甲氧苄啶胶囊的质量标准提供参考依据。