HPLC法同时测定颈脑康丸中4种活性成分的含量

李道明，程 伟

(信阳市食品药品检验所，信阳 464000)

颈康方是信阳市中医院名老中医高国举从医40余年用于治疗颈椎病及脑血管病的常用方剂，疗效显著，后改为颈脑康丸，临床观察有效率达95%以上，疗效比之汤药未见差别，且较之汤药服用方便、便于携带，深受患者欢迎。本方由黄芪、丹参、当归、赤芍、葛根、威灵仙和红花等13味中药组成，具有益气活血、通经活络的功效，临床主治颈椎病、脑梗死、脑血管病后遗症及血管性脑供血不足等。黄芪为方中君药，具有补气升阳、生津养血的功效，在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、糖尿病和延缓衰老等方面具有重要作用[1]。当归对神经系统、免疫系统也有作用，并具有抗肿瘤、抗辐射、抗炎镇痛、抗氧化和抗衰老等作用[2]。丹参具有扩张冠状动脉、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循环以及降低心肌耗氧量等作用[3]。赤芍在血液系统、免疫系统、神经系统以及心血管系统等均表现出良好的药理作用[4]。芍药苷具有调节血脂和血压等作用，可用于治疗神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病并发症等多种疾病[5]。周修森等[6]采用HPLC-ELSD法测定颈脑康丸中黄芪甲苷的含量，而本文以阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷为指标成分，建立测定4种活性成分的HPLC法，为控制该制剂的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 安捷伦1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；梅特勒-托利多XSE105十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司)；SB-5200DT超声波提取器(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2试药 阿魏酸对照品(批号110773-201614)、丹酚酸B对照品(批号111562-201514)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号111920-201304)和芍药苷对照品(批号110736-201640)，均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯(美国天地公司)；水为超纯水；其余试剂为分析纯；颈脑康丸(信阳市中医院，批号：20160512，20160925，20161106)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：BDS-Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)系统；梯度洗脱(0～45 min，乙腈比例15%～30%)；检测波长：0～9 min检测芍药苷为230 nm，9～11 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷为260 nm，11～15 min检测阿魏酸为316 nm，15～45 min检测丹酚酸B为286 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 分别精密称取阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芍药苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为18.69，89.28，18.40和90.00 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取样品2 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密量取体积分数为75%的甲醇30 mL，密塞后称定质量，超声提取30 min，冷却后用体积分数为75%的甲醇补足减失的质量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性样品溶液 按照处方比例和制备工艺分别制备不含当归、丹参、黄芪和赤芍的阴性样品，再按照2.2.2项下方法分别制备阴性样品溶液。

2.3专属性考察 取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和4种阴性样品溶液各10 μL，在2.1项色谱条件下进行测定，记录色谱图，见图1。结果表明，供试品色谱图中在与对照品色谱图上相应的位置有相同的色谱峰，且阴性样品无干扰。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.供试品；C.缺当归的阴性样品；D.缺丹参的阴性样品；E.缺黄芪的阴性样品；F.缺赤芍的阴性样品；1.芍药苷；2.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；3.阿魏酸；4.丹酚酸B。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixture of reference substances；B.sample；C.ChinsesAngelicanegative reference sample；D.Salviamiltiorrhizanegative reference sample；E.Astragalusmembranaceusnegative reference sample；F.RadixPaeoniaerubranegative reference sample；1.paeoniflorin；2.calycosin-7-O-β-D-glycoside；3.ferulic acid；4.salvianolic acid B.

2.4线性关系考察 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液1，2，5，10和20 μL，注入高效液相色谱仪，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。分别以阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的进样量为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得到阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的回归方程分别为y1=4.925x1+0.588(r1=0.999 9)，y2=1.090x2+0.940(r2=0.999 9)，y3=2.955x3+15.348(r3=0.999 7)和y4=1.232x4+14.630(r4=0.999 9)。结果表明，阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的进样量分别在18.69～373.76，89.28～1 785.60，18.40～368.00和90.00～1 800.00 ng范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果得到阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷峰面积的RSD值分别为0.62%，1.02%，0.87%和1.15%(n=6)，结果表明，该仪器精密度良好。

2.6稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在放置0，2，4，8，12和24 h后进样10 μL，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷峰面积的RSD值分别为0.32%，0.58%，0.75%和1.26%(n=6)，结果表明，24 h内供试品溶液稳定性较好。

2.7重复性实验 平行称取同一批(批号20160512)颈脑康丸，6份，每份2 g，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的含量。结果4种成分的平均含量分别为0.104，1.775，0.089和2.126 mg·g-1，RSD值分别为1.52%，0.94%，1.81%和0.64%(n=6)，结果表明，该方法重复性良好。

2.8加样回收率实验 精密称取同一批含量的颈脑康丸(批号20160512)的样品粉末6份，每份1 g，分别加入阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷对照品的混合溶液Ⅱ(质量浓度依次为3.488，58.320，2.968和71.100 μg·mL-1)30 mL，按照2.2.2项下方法制备加样供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算各成分回收率。结果表明，阿魏酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芍药苷的平均加样回收率分别为98.99%(RSD=0.82%)，99.30%(RSD=0.64%)，98.90%(RSD=1.14%)和98.98%(RSD=0.88%)(n=6)。

2.9样品的含量测定 取3批颈脑康丸，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，根据2.4项下得到的标准曲线方程计算各成分的含量，结果见表1。

表1样品含量测定结果

Tab.1 Results of content determination (mg·g-1，n=3)

3 讨论

3.1流动相的选择 本实验分别先后考察甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液和乙腈-水3种不同组成的流动相系统。甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液作为流动相时，色谱峰有部分重叠，分离不完全，且丹酚酸B洗脱时间过长；乙腈-水作为流动相进行洗脱时，分离度较好，但峰形不理想；而以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液进行梯度洗脱时，各峰分离度较好，峰形也较为美观，适应实验要求，故本研究采用此流动相系统。

3.2波长的选择 本研究在检测波长参数方面，参考现有相关文献目标成分[7-10]，采用不同时间段变换不同波长[11-12]，以各目标成分的特征吸收来保障其准确性，因此按照不同时间段设置波长参数：0～9 min检测芍药苷为230 nm，9～11 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷为260 nm，11～15 min检测阿魏酸为316 nm，15～45 min检测丹酚酸B为286 nm。

3.3指标成分的选择 阿魏酸能抑制急性脑梗死患者的血小板聚集，改善血液循环，改善患者的生活质量[13]。丹酚酸B可削弱活化血小板诱导的CMEC炎症介质的表达，对脑血管内炎症级联反应起到抑制作用，亦对脑MIRI所致线粒体损伤和神经细胞凋亡有明显抑制作用[14]。同时大量研究已证实丹酚酸B对多种心血管疾病如心肌梗死、动脉粥样硬化及心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用[15]。黄芪中的黄酮类成分作为黄芪药材的主要成分之一，具有抗心肌缺血、抗肿瘤、抗损伤、抗炎和抗突变等多种药理作用[16-19]。研究表明，芍药苷有望发展为安全、有效、可长期反复服用的抗缺血性脑卒中的药物[20]。