提高小儿盐酸赖氨酸颗粒质量标准的研究

罗 立，但晓梦

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉 430022；2.湖北省药品监督检验研究院，武汉 430064)

小儿盐酸赖氨酸颗粒主要改善儿童发育不良、食欲不振；能促进儿童生长发育及智力发展、提高机体免疫力；具有促进神经细胞的再生与代谢、提高脑组织的生理功能，用于颅脑损伤及其综合征[1-2]。现行标准收载于国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第九册，标准号WS-10001-(HD-0793)-2002[3]，该标准中检查项存在缺项，且现有含量测定方法专属性不强，不能准确测定主药含量的问题。

WS-10001-(HD-0793)-2002中含量测定方法采用非水滴定法[3]测定盐酸赖氨酸含量，该方法存在以下问题：①专属性不强、灵敏度不高；②实验过程中所用的醋酸汞会对环境造成污染，不环保；③非水滴定法测得的盐酸赖氨酸含量普遍偏低，原因可能是由于加热时间较长，盐酸赖氨酸部分分解造成[4]。有文献推荐采用可见分光光度法测定盐酸赖氨酸的含量[5]，该法仅采用茚三酮试剂与盐酸赖氨酸中的氨基反应，通过显色反应测定其吸光度值，专属性不强。也有文献推荐采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定盐酸赖氨酸含量[6]，但采用ELSD测定盐酸氨基葡萄糖时，基线不平，仪器耐用性不好，且流动相选择受限，使得药物与其成盐离子分离度不高，从而不利于药物的含量检测。此外，蒸发光散射检测器较为昂贵，实际推广应用范围受限，同时采用高纯氮气作为雾化气体，产生的废气也会对空气造成污染。

鉴于盐酸赖氨酸无特征紫外吸收波长，本实验采用HPLC异硫氰酸苯酯柱前衍生法测定小儿盐酸赖氨酸颗粒的含量[7-10]，引入生色基团法专属性强，且能同时实现盐酸赖氨酸与其他氨基酸分离，可用于小儿盐酸赖氨酸颗粒的质量控制。本文通过对小儿盐酸赖氨酸颗粒的鉴别项和检查项进行研究，草拟其质量标准。

1 仪器与试药

1.1仪器 电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；DHG-9036A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Waters 2695 Alliance高效液相色谱仪，包括柱温箱、在线真空脱气机、2487紫外检测器以及Empower色谱工作站(美国Waters公司)。

1.2试药 盐酸赖氨酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号624-201104)；盐酸赖氨酸原料药(批号20130317)，小儿盐酸赖氨酸颗粒(贵州益佰制药股份有限公司，批号：130501，130502，130503)；乙腈为色谱纯，茚三酮、醋酸钠、醋酸、异硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基正己酸、三乙胺和正己烷均为分析纯；水为超纯水。

0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈试液和1 mol·L-1三乙胺乙腈试液均为临用现配。

2 定性分析

2.1性状 收集的3批样品均为淡黄色可溶颗粒，符合现行质量标准规定。

2.2鉴别

2.2.1茚三酮鉴别反应 分别取3批样品4 g，加水15 mL，振摇使溶解，取溶液5 mL，加茚三酮2 mg，加热，供试品溶液加入茚三酮后溶液显紫色，均呈正反应，符合现行质量标准规定。

2.2.2氯化物鉴别反应 取3批样品各适量，按照《中国药典》2015年版四部通则对3批样品的供试品溶液进行测定，均呈正反应，符合现行质量标准规定。

2.2.3增加HPLC鉴别 由于拟定标准中采用HPLC法测定含量，故增订HPLC鉴别：在含量测定项下记录的色谱图中，赖氨酸峰的保留时间与其对照品峰的保留时间一致。3批样品中供试品溶液和对照品溶液的主峰保留时间均为39.7 min，保持一致。

2.3检查

2.3.1增加其他氨基酸 参照《中国药典》2015年版二部盐酸赖氨酸原料其他氨基酸项下，补充了部分实验，修订了供试品溶液的质量浓度，增加了系统适用性实验，并比较了不同展开剂比例条件下盐酸赖氨酸的比移值(Rf)。

取本品适量，加水溶解并稀释制成质量浓度为15 mg·mL-1的溶液，作为供试品溶液；精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。另取盐酸赖氨酸对照品与精氨酸对照品各适量，置于同一量瓶中，用水溶解并稀释制成质量浓度为0.4 mg·mL-1的溶液，作为系统适用性实验溶液。按照TLC法实验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用2种展开剂：正丙醇-浓氨溶液(2∶1)和正丙醇-浓氨溶液(10∶9)，展开，晾干，在100 ℃干燥10 min，放冷，喷以茚三酮的丙酮溶液(1→50)，在80 ℃加热至斑点出现，立即检视。结果表明，调整展开剂的比例能够增加盐酸赖氨酸的Rf值，但无论是赖氨酸还是精氨酸的斑点均扩散较严重，边缘模糊。因此仍保持展开剂的比例为正丙醇-浓氨溶液(2∶1)，在此比例下，采用硅胶G薄层板(手工铺板)，盐酸赖氨酸的Rf值为0.38，符合《中国药典》2015年版四部通则中对Rf值的规定。对照品溶液显一个清晰的斑点，系统适用性实验溶液显2个完全分离的斑点，3批样品的供试品溶液所显斑点颜色与对照溶液的主斑点比较，结果为浅，符合规定。

2.3.2干燥失质量 收集的3批样品在105 ℃干燥3 h，减失质量依次为8，8和7 mg·g-1，均未超过20 mg·g-1，符合现行质量标准规定。

3 含量测定

3.1色谱条件 色谱柱：Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以0.1 mol·L-1醋酸钠溶液(用稀醋酸调节pH值至6.4)为流动相A，乙腈为流动相B，水为流动相C，梯度洗脱程序见表1；流速为1.0 mL·min-1；柱温为35 ℃；检测波长为254 nm；进样量为10 μL。

表1梯度洗脱程序

Tab.1 The gradient elution procedure

时间/minA,0.1 mol·L-1醋酸钠溶液/%B,乙腈/%C,水/%09550295501980155305933839080204408020

3.2溶液的制备

3.2.1内标溶液 取6-氨基正己酸适量，加水使溶解并稀释制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液，摇匀，即得。

3.2.2供试品溶液 精密称取本品细粉适量(相当于盐酸赖氨酸20 mg)，置于50 mL量瓶中，精密加入内标溶液10 mL，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.2.3对照品溶液 精密称取盐酸赖氨酸对照品20 mg，置于50 mL量瓶中，加入内标溶液10 mL，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.2.4空白溶液 按照贵州益佰制药股份有限公司提供的处方，配制不含主药的空白溶液。

3.3衍生和测定方法 量取3.2项下制备的供试品溶液、对照品溶液和空白溶液各200 μL，分别加入1 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液100 μL和0.1 mol·L-1的异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀，室温避光放置1 h，再分别加入600 μL的正己烷，振荡，静置，分别取下层液2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照内标法以峰面积计算含量。

3.4方法学考察

3.4.1系统适用性实验 精密量取上述3种溶液各2 μL，按照3.1项下色谱条件测定，记录色谱图。空白溶液对测定无干扰，内标6-氨基正己酸(Rt=25.3 min)与盐酸赖氨酸(Rt=39.7 min)有效分离，色谱图见图1。

图1HPLC图

A.空白溶液；B.对照品；C.供试品；1.内标；2.盐酸赖氨酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank solution；B.reference substance；C.sample；1.internal standard；2.lysine hydrochloride.

3.4.2线性关系考察 精密称取盐酸赖氨酸对照品适量，用水稀释至质量浓度为7.46 mg·mL-1，作为储备液，精密量取上述储备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，置于10 mL 量瓶中，精密加入3.2.1项下制备的内标溶液2 mL，用水稀释成盐酸赖氨酸质量浓度分别为0.373，0.746，1.492，2.238，2.984和3.730 mg·mL-1的溶液。分别精密量取上述溶液200 μL，按照3.3项下方法进行衍生，按照3.1项下色谱条件测定峰面积。以主峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)进行线性回归。结果表明，盐酸赖氨酸质量浓度在0.373～3.730 mg·mL-1范围内与比值呈良好的线性关系，回归方程为y=1.298 3x+0.032 7(r=0.999 3)。

3.4.3精密度实验 精密称取盐酸赖氨酸原料，置于50 mL量瓶中，加入3.2.1项下制备的内标溶液10 mL，加水定容至刻度，制成质量浓度为0.4 mg·mL-1的溶液，摇匀。取该溶液200 μL，按照3.3项下方法进行衍生，取下层液2 μL，注入高效液相色谱仪，在规定波长处连续进样6次，其RSD值为0.4%，结果表明，该方法精密度较好。

3.4.4重复性实验 取同一批供试品(批号130501)6份，按照3.2.2项下方法制备供试品溶液，取200 μL，按照3.3项下方法进行衍生，取下层液2 μL注入高效液相色谱仪，进样测定，按照内标法以峰面积计算盐酸赖氨酸含量，其RSD值为0.2%(n=6)，结果表明，该方法重复性良好。

3.4.5回收率实验 按照贵州益佰制药处方比例分别称取盐酸赖氨酸原料药与空白辅料适量，按照处方配制成含盐酸赖氨酸80%，100%和120% 3种不同的9份模拟样品，按照3.1项下色谱条件进行测定；另取2份不加辅料的盐酸赖氨酸原料药作为对照，同法测定，计算样品回收率。结果平均回收率为100.5%，RSD值为0.7%(n=9)，见表2。

表2小儿盐酸赖氨酸颗粒回收率实验结果

Tab.2 Recovery results of lysine hydrochloride

编号加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%80%10.023 010.022 9599.74100.50.720.023 900.024 07100.7130.022 900.022 95100.22100%40.031 430.031 3399.6850.025 710.025 93100.8660.030 890.031 33101.42120%70.033 870.034 24101.0980.034 070.033 9499.6290.033 890.034 24101.03

3.4.6稳定性实验 精密吸取供试品溶液200 μL，按照3.3项下方法进行衍生，取衍生后的供试品溶液适量，在室温下放置，分别于0，2，4，6和8 h取下层液2 μL，注入液相色谱仪，测得RSD值为0.7%，结果显示，衍生后的供试品溶液在室温下放置8 h内稳定性良好。

3.5样品测定 本实验共收集到3批小儿盐酸赖氨酸颗粒。精密称取各批样品粉末适量，按照3.2.2项下方法配制供试品溶液，每批样品各制备2份，依法进样测定，每份样品重复进样2次，计算盐酸赖氨酸的含量，结果批号分别为130501,130502和130503的样品含量分别为100.3%，98.9%和98.5%，在标示量90.0%～100.0%范围内，结果均符合规定。

4 讨论

4.1色谱方法的建立

4.1.1色谱柱考察 本次实验分别考察了Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Inersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱[11-13]，结果发现,3种色谱柱的分离效果均较好，考虑到分析成本和色谱柱的普适性，建议采用常用十八烷基硅胶键合色谱柱。

4.1.2梯度洗脱条件考察 本次实验采用的流动相为流动相A[醋酸钠-醋酸缓冲液(pH值为6.4)]、流动相B(乙腈)和流动相C(水)的梯度洗脱体系，并对梯度洗脱程序进行了优化，考虑到各色谱峰的保留时间和各色谱峰分离度影响，最终确定正文中所述梯度洗脱条件。流动相A中采用稀醋酸调节0.1 mol·L-1醋酸钠溶液pH值至6.4时，盐酸赖氨酸与其临近的色氨酸峰分离度较好，且在pH值为6.4的条件下使用能保证色谱柱的使用寿命，提高方法的耐用性。

4.2衍生试剂的选择 氨基酸HPLC检测分析常用的衍生化试剂主要有异硫氰酸苯酯、2，4-二硝基氟苯、邻苯二甲醛、萘二甲醛和氨基苯甲酯类等[14-20]，由于异硫氰酸苯酯和氨基酸的反应产物苯基硫酸盐-氨基酸稳定性较好，且采用紫外检测仪进行检测，可满足国内大多数药品生产企业的检验条件。以异硫氰酸苯酯为柱前衍生剂的氨基酸分析方法具有反应速度快、产物单一稳定，与一级、二级氨基均可反应等特点，使得衍生物在紫外检测器下有较高的灵敏度，故推荐采用异硫氰酸苯酯作为本次实验的衍生试剂。

小儿盐酸赖氨酸颗粒现行质量标准采用非水滴定法测定盐酸赖氨酸含量，该法专属性不强且会对环境造成污染，拟定的方法所用仪器耗材通用，能满足国内生产企业检测条件，是一种较为理想的分析方法。