细菌nox基因研究进展

王 艳， 丁承超， 邱景璇， 陈国薇， 谢曼曼， 刘 箐*

(1.上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093；2.同济大学 生命科学与技术学院，上海 200092)

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)是一种普遍存在于活生物体中的关键辅因子，参与各种代谢及调节系统中的氧化还原反应[1]，NADH氧化酶(NADH Oxidase，NOX)是一种氧化还原酶，由nox基因编码。高等动植物nox基因编码的NADH氧化酶是一种多亚基复合体，包括催化亚基、调节亚基和结合配体[2-3]，已在人体中表征的7种催化亚基(NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox-1和Duox-2)被称为NOX家族[4]。NOX将电子从细胞内的NADH转移穿过膜并将其偶联到分子氧，从而产生活性氧(Reacyive Oxygen Species，ROS)，除了NOX4能直接产生过氧化氢(H2O2)[5]之外，其他亚型的NOX都是先产生超氧化物阴离子(O2·-)，再由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)将O2·-快速转化为H2O2[6]。正常生理条件下，NOX产生低水平的O2·-或H2O2，但贫血[7]、缺氧[8]、高糖[9]、高血压[10]等各种病理条件能激活NOX产生大量ROS，NOX衍生的ROS可能导致氧化损伤(如细胞凋亡和坏死)或作为信号分子，调节细胞迁移、增殖和分化[4,11]，另外，当机体被病原体侵袭时还具有杀菌功能[12]。研究发现，许多细菌中也存在nox基因，编码NADH氧化酶，它在调控微生物代谢方面有重要作用。然而，绝大多数nox相关的研究都集中在动植物上，细菌nox基因的研究仅停留在初步阶段。详细了解细菌nox基因及其编码产物NOX的具体作用方式及其对细胞产生的影响，对研究细菌生长及其毒力有积极意义。国内对细菌中nox基因的研究相对较少，本文综述了近年来细菌中nox基因的研究成果，并结合本实验室对单核细胞增生李斯特氏细菌(Listeriamonocytogenes,Lm)nox基因的研究进展，对目前存在的问题和未来的发展进行评述。

1 NADH氧化酶的分类及结构

1.1 NOX分类

研究表明，在氧气存在的条件下，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)[13]、变形链球菌(Streptococcusmutans)[14]及无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)[15]等细菌中的NOX能将电子从NADH(还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+))转移到O2，直接将O2还原；在无氧条件下，其他电子受体如二氯酚靛酚(dichloro-phenol-indophenol，DCIP)、甲萘醌和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)[14,16]等，也可以用作NOX的底物，在NADH存在时被还原。

目前关于NOX的具体分类没有明确的定义。综合各类文献表述，一般可根据反应产物的不同，将NOX分为三类：一类为H2O2型NOX，反应过程中2个电子发生转移产生H2O2[16]；另一类就是狭义的NOX即H2O型NOX，反应过程中有4个电子发生转移产生H2O[17]；还有一类O2-型NOX，反应过程中有1个电子发生转移产生O2-[18]。具体反应式如下：

NADH+H++O2→NAD++H2O2

2NADH+2H++O2→2NAD++2H2O

NADH+H++2O2→NAD++H++2O2-

通过代谢氧气并调节NADH/NAD+的比例，NOX可以调控多个下游靶标，涉及酸应激和氧化应激、物质转运、能量代谢和菌膜形成的多个基因，对菌体生长和毒性有至关重要的作用。

表1 10株细菌中NADH氧化酶序列对比Table 1 Sequence alignment of NADH oxidase among 10 bacteria strains

1.2 NOX氨基酸序列分析

尽管NOX分子的来源不同，但一级结构具有普遍类似性，C端均有核黄素蛋白FAD结合域和NADH结合域。表1为本文所涉及的10种细菌NOX的氨基酸序列与Lm标准菌株EGD-e的对比结果。经分析，NOX的氨基酸序列在细菌中较为保守，相似性均在30%以上，其中，粪肠球菌V583(EnterococcusfaecalisV583)的NOX的氨基酸序列与Lm-EGD-e高度相似，达到99%。

以表1所涉及的10株细菌NOX的氨基酸序列构建生物进化树如图1所示。进化树上显示粪肠球菌V583与Lm-EGD-e亲缘关系最近。

图1 基于NOX氨基酸序列构建10株细菌的进化树Fig.1 NJ phylogenetic tree based on amino acid sequence of NADH oxidase in this 10 strains of bacteria

目前关于NOX在细菌细胞内的定位还不明确，综合各类文献报道，厌氧菌主要产生H2O2型NOX，存在于细胞膜上或胞内，兼性厌氧菌(大部分是乳酸菌)主要产生H2O型NOX，且蛋白存在于胞内。2013年Muchnik等[24]使用鼠抗rNOX抗血清将野生型肺炎链球菌染色，并通过流式细胞仪检测，结果显示NOX位于细胞表面的细胞壁，且nox缺失菌株表面未检测到该蛋白。2017年Zhao等[28]在研究牛分枝杆菌(Mycoplasma bovis)的NOX相关功能时，使用抗rNOX单克隆抗体做探针，显示NOX是膜相关蛋白，在培养基上清液中不存在；使用Signal IP和TMHMM服务器进行生物信息学分析表明NOX没有跨膜结构域或信号肽。

对Lm的nox基因及NOX做了初步研究，图2为使用TMHMM Server v. 2.0分析软件对Lm中NOX的跨膜分析及定位预测，结果表明Lm中的NOX不可能为跨膜蛋白。

1.3 NOX结构

2016年Titov等[21]在人上皮瘤细胞中表达并筛选了几种H2O型NOX，其中来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的nox基因表达量最高。将LbNOX的C端以FLAG-tag标记、N端以His-tag标记并在大肠埃希菌中过表达，测得其分子大小为(197±4) kD。图3为Titov 等以X射线测定的短乳杆菌中的NOX的晶体衍射图，分辨率为2.4 Å[21]。

图2 单核细胞增生李斯特氏菌EGD-e的NOX的TMHMM跨膜分析Fig.2 TMHMM transmembrane analysis for NADH Oxidase (NOX) of Listeria monocytogenes EGD-e

图3 短乳杆菌中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型的H2O型NOX的催化二聚体的晶体结构Fig.3 Crystal structure of the catalytic dimer of the flavin adenine dinucleotide(FAD)-dependent H2O-forming NADH oxidases from Lb

2 nox基因的功能

2.1 nox基因影响细胞内氧化应激

细菌普遍具有代谢氧的能力，氧在电子传递链中作为电子受体并通过氧化磷酸化生成ATP，防止有害代谢产物的生成[29]。然而，细胞呼吸过程可导致活性氧(ROS)的产生，ROS 是生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，包括超氧自由基(O2-) 、羟基阴离子(OH-) 、过氧化氢(H2O2)等[30]。正常情况下细胞内ROS 的产生和消除是平衡的，然而，当ROS过量积累或受到某些环境胁迫时，细胞内的氧化还原平衡偏向氧化的一方，形成氧化压力[31]。ROS反应活性较高，易与其他分子发生反应，可导致蛋白质、DNA和膜脂质的损伤以及酶失活，或直接激活细胞凋亡信号通路，导致细胞死亡。

细菌发展出各种应对呼吸过程中有害代谢产物的解毒机制，人们已表征了许多与消除ROS相关的酶，包括SOD、NOX、过氧化物酶、过氧化氢酶、烷基氢过氧化物酶以及谷氧还原蛋白与硫氧还原蛋白体系[32]。有研究发现链球菌nox突变体的基因芯片与添加外源氧的菌体有相似的特点[33]，表明NOX参与了细胞的氧解毒过程。实际上在链球菌中，NOX发生高度保守的氧代谢机制，通过每次转移1个电子，将氧还原为H2O或H2O2，同时将NADH氧化为NAD+，参与酸应激和氧化应激[34]。

Yamamoto等[15]研究发现，无乳链球菌nox缺失菌株在高氧、百草枯(生成ROS)和过氧化氢(导致细胞氧化应激反应)存在的条件下，分别表现出生长减缓、停滞及存活率下降，即使向培养基中加入还原剂(如谷胱甘肽或DTT)、TIRON(消除百草枯生成的O2-)或过氧化氢酶(降解H2O2)，也不能减轻nox突变体的生长缺陷，表明nox基因影响了细菌的氧化应激能力。相似的研究表明NOX在肺炎链球菌的致病机制中有重要作用，有氧环境下缺失nox基因将导致生长速率降低[13,35]；高氧条件下，化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)nox突变体在葡萄糖限制培养基中不能生长，且对百草枯敏感性增强[36]；有氧条件下，变形链球菌nox突变体的NAD+再生受阻影响了替代的混合酸发酵途径，在甘露醇及山梨糖醇培养基的生长状态大大降低[14]。

另一方面，Li等[37]构建了干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiLC2W)nox重组菌株，结果发现厌氧条件下，nox过表达菌株的生长速率更慢且最终细胞密度也更小，表明氧化还原状态对细胞代谢具有显著影响。实际上早在2006年，Heux等[38]已提出过表达NOX可能会过量消耗NADH，胞内降低的NADH水平及NADH/NAD+比值导致糖酵解通量减少，从而影响细胞生长。

综合上述分析，缺失nox会影响细菌的氧化应激能力，对有害ROS表现出消极反应，改变细菌的生长和毒力；过表达NOX又会过多消耗胞内NADH，对细菌的有机物代谢途径产生影响，进一步影响细胞状态。由此得出NOX的主要功能是氧化NADH并还原氧以保护细胞免受自由基形成的损害，其次是对糖代谢有促进作用。

2.2 nox基因影响菌膜形成及功能

几乎所有微生物都具有黏附到物体或混合菌落表面的机制，生物膜普遍存在并有助于细菌抵抗非生物因素胁迫、抗菌剂以及宿主免疫系统的攻击。美国国家卫生研究院2003年的一份统计报告显示，80%以上的微生物感染都与生物膜有关[39]。细菌被包裹在由胞外多糖(EPS)、蛋白质、脂质和核酸组成的胞外基质中[40]，细菌的黏附和聚集作用均与生物膜基质密切相关[41]。

2016年Ge等[16]使用共聚焦激光扫描显微镜检查发现，厌氧条件下的血链球菌(Streptococcussanguinis)nox突变体在不同成分基质(不论是非生物还是生物)表面上形成的生物膜的量均显著少于野生型，且结构差异也非常大。实验菌株之间没有显著的生长差异，表明生物膜改变不是生长差异导致的，证实了nox基因确实参与血链球菌中的生物膜形成。

另外，膜流动性对于保持菌膜的性质和膜蛋白的功能至关重要，如脂质双层的渗透性、蛋白质流动性、蛋白质-蛋白质相互作用和主动运输过程等[42-46]。细菌eDNA在生物膜形成及分散中发挥重要作用[47]，膜流动性改变可能影响细菌eDNA与胞外生物膜基质的转运、易位或装配。有研究表明膜流动性与脂肪酸组成有关[48]，研究者认为不饱和脂肪酸(顺-异油酸)的减少可能会导致膜流动性降低[42]。

Ge等[16]发现厌氧条件下血链球菌nox缺失导致eDNA含量显著降低，膜中C16脂肪酸含量增加，C18脂肪酸减少，荧光各向异性表明突变体的膜流动性降低，与上述猜测一致。Yamamoto等[15]的研究表明，有氧条件下nox突变体的缺陷主要是由于总脂肪酸产量减少所导致，且突变体中的NAD+含量的降低可能影响乙酰-CoA(脂肪酸生物合成的前体)产生。

菌膜作为一种抗逆性强的生存和增殖方式，极有可能在细菌生长受到较强抑制时菌膜形成能力反而增强，形成菌膜需要多种基因协调作用，调控菌体生长代谢及群体感应等。总的来说，缺失nox基因一定程度上从菌膜丰度、脂肪酸总量及比例等方面改变了菌膜形成，对细胞膜功能产生影响。

2.3 nox基因影响细菌生长、菌间竞争能力

多个研究表明nox基因对细菌、菌间及致病菌与宿主的相互作用有重要影响。Gei等[16]通过pJFP96质粒转化验证了即使加入硫酸软骨素4磺基转移酶(Chondroitin 4 Sulfotransferase，CSP)，质粒在血链球菌nox突变体中的转化依旧受到显著抑制。不同于Auzat等[13]在肺炎链球菌中看到的，仅当不添加CSP时，pJFP96质粒在nox突变体中的转化效率才显著下降。DNA转化频率与细菌生长能力相关[49-50]，由pJFP96质粒在不同菌株中的转化效率的差别，可从分子水平上解释nox基因影响菌体生长能力的作用机制。

通常血链球菌、戈登链球菌(Streptococcusgordonii)等过氧化口腔链球菌会产生杀菌水平的H2O2以抑制变形链球菌的生长[48]。Baker JL等[51]对变形链球菌进行种间竞争能力测定，发现有氧条件下nox突变体生长能力中等损伤，厌氧条件下则不受抑制，表明NOX可能仅对有氧环境中变形链球菌的竞争能力有影响，且对H2O2敏感可能是导致竞争缺陷的主要原因。Ge等[52]反向评估了nox基因对血链球菌与变形链球菌竞争能力的影响，表明野生型血链球菌在BHI平板接触区域明显抑制变形链球菌生长，而nox突变体失去抑制能力。以上研究验证了nox基因影响链球菌消除有害H2O2的能力，缺失nox在一定程度上降低了其生长能力及菌间竞争能力。

2.4 nox基因影响细菌对宿主的黏附及毒力

不论是食品学还是临床医学，致病菌形成菌膜并就近黏附于固相载体都对其传播起到积极作用，细菌的黏附能力是体现毒力的重要因素。

Zhao等[28]通过电镀法检测牛分枝杆菌nox缺失菌株对胚胎牛肺(EBL)细胞的黏附能力，发现缺失菌株黏附量显著降低，且rNOX蛋白和抗rNOX抗血清都能不同程度抑制野生型牛分枝杆菌对EBL细胞的黏附，由此推测，牛分枝杆菌NOX是一种介导细胞黏附的细菌黏附素。Muchnik等[24]比较了肺炎双球菌nox缺失菌株和野生型菌株在小鼠体外肺上皮细胞上的黏附程度，结果发现nox缺失菌株的黏附能力显著下降，并且rNOX和兔抗rNOX抗血清都能不同程度地抑制野生型肺炎链球菌对肺源腺癌细胞系的黏附，再一次证明了NOX可能作为黏附素介导肺炎链球菌对宿主细胞的黏附作用。

相同的研究将肺炎双球菌nox缺失菌株接种于小鼠的鼻、咽和肺部，回收到的nox缺失菌株显著减少，且小鼠的存活率显著上升，表明nox缺失菌株的毒力降低。有多个研究显示，在肺炎链球菌和无乳链球菌中，缺失nox基因导致细菌在啮齿动物呼吸道、败血症和中耳炎感染模型中的毒力减弱[13,15]；在血链球菌中，nox突变体在兔心内膜炎感染模型中的毒力减弱[52]；在屎肠球菌(Enterococcusfaecium)中，缺失nox基因导致其在线虫蠕虫秀丽隐杆线虫感染模型中的杀伤活性显著降低[53]。

与上面结果相反的是，本实验室以不同Lm菌株侵袭人结肠腺癌细胞(Caco2)和人肝癌细胞(HepG2)，以流式细胞术检测被Lm侵袭后的Caco2和HepG2的凋亡情况，发现nox缺失菌株可诱导更多的细胞凋亡，nox过表达菌株相反；另外，我们检测了细胞产生的超氧化物和H2O2，发现与其他菌株相比，当细胞被nox缺失株侵袭时ROS水平反而下降，相对应的细胞炎症因子也被抑制。一系列实验表明Lm的nox缺失株似乎表现出更强的侵袭能力，这是与已知的其他细菌nox基因功能相反的结果，有待进一步验证[54]。

综合上述实验结论，nox突变体在血液中生存率降低可能是动物感染模型中毒力改变的原因之一，另一种可能性是nox突变体对宿主细胞内的H2O2水平变化有影响，从而改变了宿主对病原菌的抵抗能力。这些结论提示可以将nox作为研究靶点，探究致病菌毒力调控的分子机制，从而为解决致病机理、细菌抗药性等问题提供可能性。

2.5 nox基因影响代谢产物生成

NOX位于多个调节途径的交集，其本身也被这些途径调节。细菌糖酵解过程NAD+转化为NADH，而NOX将NADH转化为NAD+以维持NAD+/NADH比例的平衡，从而对糖酵解过程的进行起重要作用。

Li等[37]研究发现有氧条件下干酪乳杆菌nox重组菌株过表达NOX时，NADH参与丙酮酸转化为乳酸过程，过度消耗NADH，乳酸盐产量急剧下降，导致更多碳源进入外多糖EPS的生物合成途径。有氧条件下乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)过表达NOX时，胞内NADH/NAD+比例降低，葡萄糖分解代谢过程中的全同型发酵转化为混合酸发酵[14,55-56]。Felipe等[57]也提出乳酸杆菌中辅因子NADH/NAD+平衡的调节会转移碳通量减少乳酸的产生，并有利于其他代谢产物的产生。Yamamoto等[15]发现尽管nox突变体在有氧条件下的生长受到影响，但大多都正常地管理中枢能量代谢，如糖酵解(尽管葡萄糖消耗速率稍微降低)，然而，nox突变体似乎不能进行一些支链代谢途径，即涉及乙酸盐和乙偶姻生产的支链。

3 展 望

nox基因在高等动植物体中的研究已趋于成熟，但在细菌中的研究少之又少，目前仅在19 种细菌中报道了nox基因。Patchett等在研究Lm(NCTC 7973)氧化代谢过程中，通过外源加入NADH的方法，首次证实Lm中存在NOX活性[58]，但在目前已报道的19 种菌中却不包含Lm，基于此对Lm的nox基因的功能做了初步研究，但经过同源性对比，发现其和高等动植物的nox基因同源性较低，另外其在细菌生长毒力方面的作用也与已知的19种细菌有所差异[54]。

已发表的文献表明细菌nox参与调节毒力，然而nox的确切功能仍然是有争议的，一些研究发现缺失nox导致一些细菌的毒力降低，但也有研究表明相反的结果。迄今为止潜在的作用机制仍不清楚，并且可能在不同的细菌之间是不同的。我们认为当病原菌进入宿主细胞时，宿主细胞可以识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，一旦识别入侵细菌，宿主细胞产生大量的ROS以抵抗细菌感染，称之为氧化爆发[59]。为了确保在宿主细胞中存活，许多病原菌已经发展出抑制ROS产生的机制，也许nox基因也参与了宿主-病原菌的相互作用之中。

综上所述，NOX广泛存在于细菌中，其除了最基本的氧化还原活性之外，还存在其他作用，是一种重要的与毒力相关的因子。其中，文献已明确指出NOX通过调节氧气和NAD+水平，涉及调控氧化还原传感调节剂REX和转录因子SPX等蛋白质，从而影响全局调节途径。缺失nox基因导致细胞在氧化应激反应、菌膜形成、毒力等方面的各种缺陷，且代谢途径发生显著改变[60-61]。

高等动植物中的nox基因主要参与机体的防御机制，并调节生长和发育，其表达的NADH氧化酶是一种与膜和胞浆相关的多酶复合体。近年来对细菌中nox基因及其编码的NOX的研究正在逐渐深入，在微生物学、医学等多个学科均取得了一定成果，但多数研究集中在nox基因与细菌宏观生长、毒力、代谢等之间的相关性，NOX具体的定位、作用方式和作用通路尚不明确。

有研究指出，细菌菌膜与细菌产生抗药性及致病力增强相关[62]，nox基因对菌膜形成的影响可能是一个突破点，深入解析菌膜形成过程中的分子调控机制，有助于更好地理解细菌形成菌膜的生存方式以及开发和研制新型高效的抗菌剂和药物，或者结合预测微生物学、微生物风险评估等研究方法，可应用于临床医学、医疗器械及食品安全等方面。

还有一些研究表明，NOX起到黏附素作用，可以作为致病菌的抗原决定簇引起小鼠的特异性免疫应答，由于其与人序列同源性较低且在细菌中比较保守，未来可以将其作为某些蛋白质疫苗的候选者。又由于NOX作为一种重要的毒力相关因子，缺失nox基因会在一定程度上降低致病微生物对宿主的毒性，有必要研究nox基因在动物宿主感染模型中的作用机制，考虑其作为减毒疫苗的可能性。

另外，由于NOX作为辅因子参与各种代谢及调节系统的反应，通过工程化调控NOX的再生水平，可以改变代谢通量，从而优化各种代谢产物的生产。