紫外光谱法测定金银花提取物中有机酸的含量

贾学忠

金银花是临床中常用中药，其具有疏风散热、清热解毒之功效，多用于治疗风热感冒、温病发热、痈肿疔疮等症。其主要含有有机酸、黄酮类、挥发油等化学成分，其中有机酸是金银花的主要有效成分[1]。在含金银花的中药制剂生产中，如银花泌炎灵片，通常是以金银花提取物作为处方原料药，其主要成分为绿原酸等有机酸[2]。绿原酸虽为金银花质量控制的指标成分，但金银花的内在质量并不是靠单一成分所决定的，而是多种成分相结合，并同时起作用才可达到预期效果[1-2]。本研究采用紫外线光谱法对银花泌炎灵片中金银花所含有机酸进行含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外分光光度计（DR600哈希HACH），2F-I型紫外分析仪（上海顾材电光仪器厂），微量进样器、薄层色谱硅胶预制板G板（烟台市化学工业研究所提供），CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 KHz），SARTORIUS GOTINGEN精密天平[德国生产，精度0.000 01]，JN-A型精密扭力天平（上海第二天平仪器厂）。

1.2 试药

绿原酸（成都天源天然产物有限公生产，5 kg/包，批号：110753-201410）为对照品，购自中国药品生物制品检定所；三氯化铁、铁氰化钾、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿均为分析纯。

2 方法

2.1 对照品溶液制备

先将金银花绿原酸、异绿原酸置于P2O5，真空环境中干燥24 h，准确称取干燥后的金银花绿原酸、异绿原酸对照品各10 mg，并将对照品置于25 ml棕色瓶中，加入适量50%甲醇，混匀，制成浓度为40 μg/ml的高效液相用对照品溶液，准确量取此储备液1 ml，置于50 ml量瓶中，加入适量50%甲醇，混匀，制成浓度为8 μg/ml的紫外分光光度法的对照溶液。

2.2 待测样品制备

取金银花10 g，研成粉末，用70%乙醇溶液回溜2次，每次3 h。在回溜时加入乙醇，第1次乙醇加入量为生药量的8倍，第2次为6倍，回溜结束后合并提取液，过滤出乙醇，并将其浓缩至相对浓度为1.2～1.5（60°）。测定金银花中绿原酸、咖啡酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸含量，用紫外吸收光谱扫描金银花提取物溶液，扫描范围为220～400 nm，采用偏最小乘法建立样品紫外吸收光谱与5种有机酸含量之间的校正模型，并考察模型的预测能力。

3 结果

3.1 样品中5种有机酸含量分布情况

所有样品中5种有机酸含量分布情况如表1所示。5个校正模型对预测集样本的预测值与对照值的相关系数均＞0.9，相对预测误差分别为1.42%、-2.11%、0.36%、5.21%、3.27%。预测结果准确。

表1 样品中5种有机酸含量分布范围（%）

表2 有机酸校正重现性实验参数

3.2 精密度实验

按照标准曲线项下操作方法重复测定供试品溶液6次，结果显示RSD为0.31%，n=6，提示精密度良好。

3.3 重现性实验

准确称取6份同一样品，每份样品重约0.5 g。按供试品溶液制备法制备溶液，按标准曲线项下操作法进行测定。借助PLS法建立金银花提取物紫外吸收光谱，及6种有机酸HPLC法对照值的重现性校正模型，结果RSD为1.08%，n=6，提示重现性好，见表2。

3.4 稳定性实验

按标准曲线项下操作法，分别于供试品溶液制备后0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h进行测定，RSD为0.74%，n=6，测定结果表明，样品溶液在5 h内基本稳定。

3.5 回收率实验

采用加样回收法。准确称取6份样品，每份样品重约0.25 g。分别准确加入绿原酸对照品0.25 mg、0.50 mg、1.00 mg，3水平共6份按供试品溶液制备项法进行制备，按标准曲线项下操作。经测试结果发现，样品在1.00 mg回收率较高。

4 讨论

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花。性寒味甘，归心、肺、胃经，具有疏风散热、清热解毒之功效，且有“中药中的抗生素”之称，多用于治疗风热感冒、温热发病、痈肿疔疮、热毒血痢等症。国内外研究人员对金银花的化学成分进行了大量研究，发现金银花提取物及所含有的化学成分具有多种药理活性[3-5]，主要体现在：（1）抗炎活性：霍晓芳等人研究表明，金银花提取物中的绿原酸能显著抑制细胞中NO的释放，并降低NF-κB p65的表达[6]。（2）抗菌活性：金银花有着较强的广谱抗菌效果，通过应用微量量热法测定金银花中不同化合物对大肠杆菌代谢的影响，结果显示不同化合物对大肠杆菌的生长均起到了一定的抑制作用，其抑制效果为：总异绿原酸＞总绿原酸＞总黄酮＞总环烯醚萜。（3）抗病毒活性：金银花对呼吸道的常见病毒有着显著的抑制效果，当绿原酸浓度不同所抑制的呼吸道病毒种类也不相同，其中常见的呼吸道病毒为RSV、柯萨奇B3、腺病毒7型、腺病毒3型和柯萨奇B5型等[7-9]。（4）抗氧化活性：绿原酸能够有效的清除3中活性氧，且其清除能力与浓度呈剂量关系，当绿原酸浓度为0.1 mg/ml时，其对过氧化氢（H2O2）的最大清除率可达95.43%。（5）抗肿瘤活性：当金银花中绿原酸、原儿茶酸和木犀草素的浓度达到100 μmol/L时可对HepG2肝癌细胞发挥细胞毒作用[10-11]。

在金银花中药制剂生产中，如银花泌炎灵片，通常是以金银花提取物作为处方原料药，其主要成分为绿原酸等有机酸，但金银花中药制剂的在内在质量并不是靠单一成分所决定的，而是多种成分相结合，因此快速、准确的测定有机酸含量对详细了解金银花提取物和控制中药制剂内在质量有着重要意义[12]。传统测定金银花提取物中有机酸含量的方法有HPLC法、分光光度法等，但这些方法的步骤较为繁琐，分析时间过长，无法满足中药生产快速分析的需求。

综上，紫外光谱法用于测定金银花提取物中有机酸含量，灵敏度高，重现性好，可建立金银花提取物中有机酸的紫外光谱定量分析模型，符合对金银花提取物进行快速分析的要求。