我国中低纬度地区白蜡DNA图谱构建及SSR标记遗传多样性分析

李庆国 刘翠兰 姚俊修 王因花 王开芳 任飞 燕丽萍 吴德军

摘要：白蜡是我国一种常见绿化树种，因纬度位置、海拔高度和海陆分布等自然地理因素不同，造成地区之间种质资源的自然差异。真实性和纯度是种质资源检测的重要指标之一，因此建立快速、精准、便捷的 SSR分子标记技术对于白蜡种质的溯源及新品种授权具有重要意义。本研究以2013年山东省林业科学研究院在白蜡种质资源调查项目中采集并保存的38份白蜡为试材，利用SSR分子标记技术对我国不同纬度地区的白蜡种质资源进行指纹图谱构建，从150对候选引物中成功筛选出15条特异性强、条带清晰的引物作为核心引物，共检测出3.8个基因型，每对引物扩增的基因型2～6个不等。并构建白蜡DNA指纹图谱，采用5对引物组合即可将38份白蜡种质完全区分。聚类分析结果表明，白蜡种质间的亲缘关系与纬度因素具有一定的相关性。

关键词：白蜡；中低纬度地区；SSR；DNA 指纹图谱；遗传多样性

中图分类号：S792.41：Q75 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0019-05

Construction of DNA Fingerprinting and Analysis of

Genetic Diversity with SSR Markers for Fraxinus sp.

in Mid-Latitudes and Low-Latitudes of China

Li Qingguo1， Liu Cuilan1，2，Yao Junxiu1，2， Wang Yinhua1，2，

Wang Kaifang1，2，Ren Fei1，Yan Liping1，2，Wu Dejun1，2

（1. Shandong Academy of Forestry Sciences， Jinan 250014， China；

2. Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， China）

Abstract Fraxinus is a kind of common greening tree species in China. Because of the latitude， altitude，sea land distribution and other different natural geographic factors， the natural differences are present between regions and germplasm resources. The authenticity and purity are one of the important indexes for germplasm resource detection. Therefore， it is of great significance to establish a rapid， accurate and convenient DNA molecular marker technique for the traceability of Fraxinus germplasms and the authorization of new varieties. In this study， 38 samples of Fraxinus collected and preserved by Shandong Academy of Forestry Sciences in 2013 were tested. The construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers were conducted for Fraxinus in mid-latitudes and low-latitudes. And 15 primers with high specificity and clear bands were selected as core primers from 150 pairs of candidate primers. A total of 3.8 genotypes were detected， and each pair of primers amplified 2～6 genotypes. The Fraxinus could be distinguished by 5 primers. This indicated that there were correlations between phylogenetic relationships and geographic origin of different varieties.

Keywords Fraxinus； Mid-latitudes and low-latitudes； SSR； DNA fingerprinting； Genetic diversity

白蠟由于其耐盐性极强、观赏价值高和分布范围广等特点，被国内许多省市广泛引种栽培，是目前应用最广泛的绿化树种之一[1]。国内对白蜡育种的研究起步比较早，但多限于对绒毛白蜡的变异观测和人工林栽培选择育种方面，且未广泛采用生物技术等新兴技术开展研究，致使白蜡遗传育种方面的研究迟滞不前，培育出的优良品种很少[2，3]，在一定程度上造成白蜡种质资源的浪费；同时，现有白蜡种间鉴别不清的问题也普遍存在[4]，白蜡种内的变异类型没有一致的划分标准，分类不明晰，缺少白蜡种质基因库以及种质资源保护、评价、推广和利用的综合体系建设[5]。由于形态鉴定的时效性差，极易受到环境与主观因素的影响，使得依据形态性状进行品种田间检验的难度越来越大[6]，品种多、杂、乱的现象难以得到有效控制。

随着分子生物学的迅速发展，采用分子标记鉴别植物品种得到广泛应用。SSR分子标记具有快速简单、自动化等优点，基于此的DNA 指纹图谱鉴定技术精准、可靠，不受季节和环境的影响，是品种鉴定的最主要分子标记技术之一[7]。国际植物新品种权保护联盟（UPOV）在分子标记测试指南中即采用SSR和SNP标记方法构建DNA指纹数据库，其中SSR标记价廉、技术成熟，是目前植物基因组建库的首选标记[8]。近年来，科研人员已基于SSR标记构建了玉米[9]、甜瓜[10]、中国樱桃[11]、杏[12]、杜仲[13]等的基因组DNA指纹图谱数据库。在白蜡树种分子标记研究方面，王健兵等[14]利用正交设计试验优化了白蜡SSR反应体系，筛选出多态性、稳定性、重复率均较高的SSR引物标记，为白蜡种质SSR分子标记的鉴定奠定了基础；胡春龙[15]采用SSR标记方法，对白蜡种质资源分子身份证及遗传多样性进行了研究。但关于中国不同纬度地区的白蜡种质开展DNA指纹图谱构建及应用的研究还未见报道。本研究采用SSR标记对2013年收集的中国不同纬度地区部分白蜡种质进行DNA指纹图谱构建，并进行遗传多样性分析，对白蜡品种鉴别、种质资源管理、杂交育种、知识产权保护和苗木质量提高均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用的38份白蜡试材为2013年山东省林业科学研究院白蜡种质资源调查项目组采自黑龙江、新疆、北京、甘肃、山东、陕西和湖南6个省市，均为当地树龄长且具有干形直、绿期长等优良特性的白蜡种质（表1）。

1.2 DNA的提取及检测

按照均匀分布、随机采集的原则取白蜡试材的新鲜叶片并置于-50℃保存，采用改进 CTAB法提取基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，带型清晰（图1），符合实验要求。

1—13分别指白蜡1号—白蜡13号。

图1 白蜡基因组DNA检测

1.3 引物筛选和PCR扩增

选取田间表型性状差异较大的4份白蜡种质提取DNA进行SSR引物筛选，所用引物由山东省林业科学研究院通过转录组测序开发，初步选出150对SSR引物作为本研究的候选引物，由山东沃恩科技有限公司合成。PCR反应体系：10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，5～10 ng/μL DNA模板0.2 μL，10 ng/μL PCR-Mix 5.5 μL，ddH2O 3.7 μL，共计10 μL。PCR反应条件：94℃ 预变性3 min；94℃变性1 min，54～58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃ 10 min终止反应。扩增产物进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：扩增产物点样3.5 μL，分子量标准为50 bp DNA Ladder，在200 V 电压下预电泳30 min，之后电泳2 h，在0.1%的AgNO3 溶液中银染，漂洗，NaOH 溶液中显色[16]，凝胶扫描保存，统计数据后进行分析。

1.4 数据处理

根据SSR扩增目标产物在电泳凝胶上的大小和重复单元，每对引物产生的不同带型，建立其DNA分子指纹图谱。利用NTSYS-pc V 2.10软件，将数据格式转换为软件计算格式，采用Popgene 32软件计算I值（Shannons information index）和H值（Neis gene diverity），多态信息含量PIC值 （polymorphism information content）参考Nei的方法进行计算[17]。采用最短距离法得出PUGMA亲缘关系图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

用150对引物（Y1～Y150）对4份白蜡种质进行扩增，初步筛选出15对特异性强、稳定性好的多态性引物，15对引物对38份白蜡材料的扩增结果见表2，共扩增出57个多态性位点，每对引物的多态性位点2～6个不等，平均每对引物扩增出3.8个多态性位点。不同位点的PIC值变化范围为0.625 1～0.917 1，平均PIC值为0.807 7；I值最大为0.921 4，平均值为0.757 3；H值平均为0.777 9。一般认为PIC>0.50时为高度多态性信息引物，当0.25

2.2 品种指纹图谱分析

利用筛选的15对引物对38份白蜡种质进行指纹分析，仅用1个特征引物Y132就可将白蜡7号、白蜡10号、白蜡13号、白蜡14号、白蜡15号、白蜡18号、白蜡23号、白蜡26号、白蜡32号、白蜡34号共计10份种质与其它种质区分开。白蜡1号、白蜡3号和白蜡4号具有5个特征引物，白蜡2号、白蜡5号、白蜡9号、白蜡11号、白蜡20号和白蜡21号具有2个特征引物，白蜡25号具有3个特征引物。引物Y78、Y132在36份白蜡种质上均表现出特征谱带，说明这两个引物多态性丰富，特征谱带稳定，在进行白蜡种质指纹鉴定时可优先采用。

从15 对引物中挑选多态性相对丰富的Y78、Y132和Y149引物进行组合鉴别，可以鉴别26份种质。Y55、Y78、Y132和Y149引物组合可鉴别34份种质，白蜡1號、白蜡5号、白蜡6号、白蜡12号4个种质无法区分，而引物Y39在这4份白蜡种质中显现出4种不同基因型，因此，采用Y39、Y55、Y78、Y132和Y149组合可将来自不同纬度地区的38份白蜡种质完全区分开。

2.3 不同来源地无性系之间的亲缘关系

利用SSR标记对38份白蜡种质进行聚类分析，结果见图2。可以看出，在0.63的聚类水平上，可以将38份种质分为两个大类。第一大类只有一份种质白蜡18号，是课题组从湖南省引进的种质资源。第二大类包括37份种质，在0.43的聚类水平上，可划分为两个亚类，第一亚类包括白蜡2号、白蜡4号、白蜡8号、白蜡10号、白蜡12号、白蜡14号、白蜡22号、白蜡24号、白蜡26号、白蜡30号、白蜡32号、白蜡36号共12个种质，其中5个种质来自黑龙江，4个种质来自北京，3个种质来自新疆；第二亚类包括白蜡1号、白蜡3号、白蜡5号、白蜡6号、白蜡7号、白蜡9号、白蜡11号、白蜡13号、白蜡15号、白蜡16号、白蜡17号、白蜡19号、白蜡20号、白蜡21号、白蜡23号、白蜡25号、白蜡27号、白蜡28号、白蜡29号、白蜡31号、白蜡33号、白蜡34号、白蜡35号、白蜡37号、白蜡38号共25个种质，其中11个种质来自陕西，9个来自山东，4个来自甘肃，1个来自北京。SSR分子标记的聚类结果与种质的纬度空间分布具有一定的相关性。可见，SSR分子标记在一定程度上反映了种质的地理分布特点。

3 讨论与结论

解决白蜡育种和种质资源管理方面的问题，研究其物种的遗传多样性和种质间的亲缘关系具有非常重要的意义[19]。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR技术对白蜡种质SSR反应体系进行优化和遗传多样性分析，前人已有研究报道，其结果为平均每对引物检测到3.5个多态位点，多态性信息含量（PIC）平均为0.548 0[14，15]。本研究遴选了15对多态性引物对38份白蜡属植物进行遗传多样性分析，所有引物均表现出了多态性，每对引物的多态性位点2～6个不等，平均每对引物扩增出3.8个多态性位点；不同位点的PIC值变化范围为0.625 1～0.917 1，平均PIC值为0.807 7，这一结果高于前人的研究结果，可能与所选用的38份白蜡种质来自中国的中、低纬度不同地区有关。黎中宝等[20]曾对不同纬度地区的桐花树进行遗传多样性研究，得出的结论为桐花树的亲缘关系与地理因素具有一定的相关性。

目前很多国家在林木新品种审定时都需要DUS证明，用于区分新品种与已知品种的不同[21，22]。近年来SSR分子标记技术由于具有简单、重复性好、共显性的特点得到广泛运用。本试验采用SSR技术构建了中国不同纬度地区38份白蜡种质的DNA指纹图谱，从15对SSR引物中筛选出5对Y39、Y55、Y78、Y132和Y149组合可将来自不同纬度地区的38份白蜡种质完全区分开。随着白蜡新品种的不断推出，品种的指纹图谱还需要不断加强，这就需要研究者不断筛选出新的核心引物，为今后新的品种尽可能提供指纹认证，只有如此，才可能更好地构建种质资源保护、评价、推广、利用的综合体系建设[18，23]。

本研究聚类分析结果显示，以纬度为分类可将所有种质分为2大类，来自低纬度湖南的聚为一类，而来自新疆、黑龙江、甘肃、陕西、北京、山东中纬度地区的白蜡种质聚为一类，说明纬度因素对种质有很大影响，即种质间的亲缘关系与地理来源有一定的相关性。来源纬度相近的黑龙江5个、北京4个、新疆3个种质聚为一类；来源纬度相近的陕西11个、山东9个、甘肃4个、北京1个种质聚为一类。可以看出大部分地理来源相同的种质聚在了同一类群中，但也有少部分不同地理来源的种质聚在同一类群，这可能是由于不同生态环境下种质资源的基因交流，导致不同生境条件下的种质资源的亲缘关系发生了变化[24-26]。不同种植区的生态环境变化和地区间产生的基因交流也有利于其遗传变异的积累和保持。

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