利用分子标记辅助选育低谷蛋白水稻新品种

郭涛　王海凤　薛芳　房文文　林香青　张士永

摘要：谷蛋白是水稻种子中含量最高的贮藏蛋白，占种子总蛋白的70%以上，是稻米蛋白中可供人体吸收的主要成分。但蛋白质摄入过量会加重肾病和糖尿病患者的病情。低谷蛋白稻米可作为肾病患者的食疗辅助品，减少患者蛋白摄入量，有效缓解病情。本研究通过引进1份江苏省农业科学院粮食作物研究所低谷蛋白新种质2054（材料种植编号HNG1），于2013 年配置其与优良食味米水稻品种圣稻735的杂交组合，经过4次回交，然后自交，并结合分子标记辅助选择，于2017年选育出1个低谷蛋白新品系17F2J3。经过分子标记检测和种子总蛋白SDS-PAGE分析表明，这个家系谷蛋白含量均降至LGC-1水平，显著低于圣稻735，且农艺性状表现优异，为黄淮稻区低谷蛋白水稻生产提供了优良种质材料。

关键词：水稻；低谷蛋白；LGC-1基因；分子标记辅助选择

中图分类号：S511.035.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0029-06

Breeding of Rice Varieties with Low Glutelin

Content by Molecular Marker-Assisted Selection

Guo Tao， Wang Haifeng， Xue Fang， Fang Wenwen， Lin Xiangqing， Zhang Shiyong

（Shandong Rice Research Institute/Shandong Rice Engineering Technology Research Center， Jinan 250100， China）

Abstract Glutelin is the most abundant storage protein in rice seeds，accounting for over 70% of the total seed protein. It is the main component of rice protein that can be absorbed by human body. But excessive protein intake can worsen the condition of patients with kidney disease and diabetes. Rice with low glutelin content can be used as functional food for patients with kidney disease， reducing the protein intake and effectively relieving the disease. In this research， the low glutelin content （LGC） improved rice variety 2054 named HNG1 was introduced from Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， and crossed with Shengdao 735 in 2013， a japonica variety with high eating quality in our lab. After consecutively four backcross using Shengdao 735 and then self-cross， in combination with molecular marker assisted selection， a new low-gluten line 17F2J3 was bred in 2017. Molecular marker detection and SDS-PAGE analysis showed that the glutelin content of the new strain was reduced to LGC-1 level and significantly lower than Shengdao 735. It would provide elite germplasms for low-glutelin rice production.

Keywords Rice； Low glutelin content； LGC-1 gene； marker-assisted selection

水稻是我國最重要的粮食作物之一，我国60%以上人口以大米为主食。水稻种子蛋白质含量占粒重的7%～10%，其中谷蛋白是最主要的储藏蛋白，也是最容易被人体吸收的蛋白，约占稻米总蛋白的 60%以上[1]。因此提高谷蛋白含量能增加稻米中可吸收蛋白的含量，提升稻米的营养价值。然而，对于肾脏病人和并发肾脏机能损害的糖尿病人来说，摄入过高的可吸收性蛋白会增加肾脏负担，导致病情恶化[2]。近年来，随着肾脏病人和并发肾脏机能损害的糖尿病患者人数不断增加，低谷蛋白含量食品的市场需求越来越大。 为满足这类病人的食谱要求， 培育低谷蛋白含量的品种已成为水稻育种的一个热点[3]。

水稻种子中的蛋白质，依据其溶解特性可分为4种：溶于水的清蛋白（albumins），溶于稀盐溶液的球蛋白（globulins），溶于醇溶液的醇溶蛋白（prolamins）和溶于稀酸或稀碱溶液的谷蛋白（glutelins）。 其中谷蛋白含量最高，占总贮藏蛋白的 60%～75%，醇溶蛋白次之，占20%～25%，还有少量的清蛋白和球蛋白[4]。谷蛋白由37～39 kD酸性亚基（α）和22～23 kD 碱性亚基（β）组成，在胚乳中以二型蛋白体（protein body Ⅱ， PB Ⅱ）形式存在。它首先在内质网膜上合成，随后被高尔基体修饰去掉信号肽，形成前体，并被运送到液泡，经修饰性蛋白酶水解裂解为成熟的酸性亚基（α）和碱性亚基（β），并储藏于PB Ⅱ中[5]，在人体中经过蛋白酶分解后被吸收利用。醇溶蛋白贮存在致密的一型蛋白体（protein body Ⅰ， PB Ⅰ）中，不能被人体消化利用[4，6]。

日本学者通过化学诱变手段获得一个种子胚乳谷蛋白含量明显降低的突变体 NM67，再利用原始亲本进行轮回选择，培育出第一个低谷蛋白水稻 LGC-1[7]。与普通水稻相比，LGC-1中可吸收的谷蛋白明显减少，谷蛋白含量低于4%。万建民等[8]以 LGC-1为母本，与日本优质粳稻越光杂交配组，并以越光为轮回亲本连续回交并结合分子标记选择，培育出了国内第一个低谷蛋白水稻新品种 W3660。张云辉等[9]将LGC-1与江苏大面积推广的优良品种武育粳3号杂交，经过6代分子标记辅助选择及SDS-PAGE验证，选育出3个综合农艺性状优良的低谷蛋白粳稻新品系。陈达刚等[10]利用W3660与优良籼稻品种五山丝苗杂交、回交，并结合分子标记辅助选择，将LGC-1基因导入籼稻品种中，选育出一个农艺性状优良的籼型低谷蛋白水稻新品系。

本实验室于2013年从江苏省农业科学院种质资源库引进张云辉等[9]创制的3个低谷蛋白粳稻新品系2054、2059 和 2084，分别命名为HNG1、HNG2和HNG3，在山东试验种植，发现其生长量偏小，茎秆变细易倒伏，穗子变小，且着粒密度降低，穗粒数变少，不适宜山东及黄淮稻区北部种植。随着低谷蛋白大米需求量的增加，生产中急需适宜黄淮稻区种植的低谷蛋白水稻新品种。本研究利用其中的1个低谷蛋白粳稻新品系2054（田间编号HNG1），与本课题组选育的优良食味水稻圣稻735配置杂交组合，利用圣稻735连续进行4次回交，并进行了3次自交，且从BC1F1代开始，每个世代的每个单株均进行LGC-1基因型检测，于2017年选育出1个适宜黄淮稻区种植的综合农艺性状优良的低谷蛋白中熟中粳水稻新品种17F2J3，其谷蛋白含量、株高与 LGC-1 相当，生育期、穗部结构、单株理论产量等农艺性状显著优于HNG1，这为黄淮稻区低谷蛋白水稻生产提供了优良的品种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为引进的低谷蛋白新品系HNG1和受体亲本圣稻735。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 从BC1F1世代开始，每个世代的材料均按单株在分蘖盛期挂牌取叶片，并冻存于-20℃冰箱。采用稍加修改的CTAB法提取植物总DNA，将叶片盛入2.0 mL 离心管中，65℃烘干，放入钢珠，打样器研磨至粉末状；随后加入600 μL 65℃预热的2×CTAB提取液（含2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA），65℃ 温浴30 min，期间振荡两次；加入600 μL氯仿混匀，12 000 r/min离心10 min，取出后吸取300 μL上清液到一个新的1.5 mL离心管中；加入300 μL异丙醇轻轻颠倒混匀，室温静置30 min；12 000 r/min离心10 min以沉淀DNA，倒掉上清液；加入600 μL 75%乙醇洗涤沉淀，倒掉上清液，放入通风橱内吹干DNA；加入200 μL TE（10 mmol/L Tris-base， 0.1 mmol/L EDTA）溶解DNA，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 分子标记检测 分子标记的选用参照Chen等[11]的方法，2 对引物分别为 InDel-Lgc1-1：正向引物序列5′-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3′，反向引物序列 5′-CTGGGCTTTAACGGGACT-3′； InDel-Lgc1-2：正向引物序列 5′-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3′，反向引物序列 5′-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3′。PCR反应体系（20 μL）包括：2×PCR Buffer for KOD FX 10 μL，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，KOD FX酶0.2 μL，ddH2O 补至20 μL。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35个循环；68℃延伸5 min；10℃保温。反应产物在GelRed预染的1%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外凝胶成像仪上观察记录。

1.2.3 种子总蛋白提取和SDS-PAGE分析 新创制的品系和亲本材料，每株各取20粒成熟种子，蛋白提取參照Cagampang等[12]。将种子在研钵中碾碎后，称取20 mg转移到1.5 mL离心管，加入700 μL蛋白提取液（8 mol/L 尿素，4% SDS，5% β-巯基乙醇，20%甘油，50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，少量溴酚蓝指示剂），涡旋混匀，放入50℃烘箱6～8 h，期间颠倒样品数次以提取充分，12 000 r/min离心 5 min，将上清转移至新的离心管中备用，用于SDS-PAGE分析。采用Bio-Rad梯度灌胶系统制备8%～18%梯度分离胶，浓缩胶浓度为6%。取5 μL上清液点样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，80 V电泳1 h，过浓缩胶界面后120 V电泳2 h。电泳完毕后凝胶在染色液（0.1% 考马斯亮蓝R250，25%异丙醇，10%乙酸）中染色2 h后，在10%乙酸中脱色至背景透明，蛋白条带清晰。蛋白凝胶采用Bio-Rad凝胶成像仪（Molecular Image ChemiDOCTM XRS+ Imaging system）Image Lab 5.2软件拍照，选取“蛋白胶的考马斯亮蓝染色模式”，拍照完成后该软件分析各泳道条带，并对各条带蛋白量进行定量，计算谷蛋白占总蛋白的比例，重复取平均值。根据农业部稻米及制品质量监督检验测试中心测得的总蛋白质含量，计算得到送检样品的谷蛋白含量绝对值。

1.2.4 农艺性状调查 水稻成熟期新品种和亲本各随机选 10 个单株，分别考察株高、单株有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、粒长、粒宽和千粒重，取平均值作为材料的性状值。

2 结果与分析

2.1 低谷蛋白水稻新品系的选育过程

2013年从江苏省农业科学院引进了HNG1种质资源，并用优良食味水稻新品种圣稻735为母本、HNG1为父本配置杂交组合。同年冬天海南种植F1，并用圣稻735进行回交，获得BC1F1种子。2014年济南正季种植23株BC1F1，挑选生育期适中、农艺性状好的单株利用分子标记进行基因型检测，检测结果带有低谷蛋白基因型的单株共5株，分别用圣稻735与其回交，得到BC2F1种子。同年冬天在海南分别种植BC2F1群体，每个群体20株，挑选抗稻瘟病、农艺性状好的单株进行分子标记检测，检测结果带有低谷蛋白基因型的单株共4株，分别用圣稻735与其回交，得到BC3F1种子。2015年济南正季种植4个BC3F1群体，每个群体20个单株，挑选生育期适中、农艺性状好、丰产性好的单株进行分子标记检测，检测结果带有低谷蛋白基因型的单株共6株，分别与圣稻735进行回交，获得BC4F1种子。同年冬天海南分别种植BC4F1群体，每个群体20株，挑选抗稻瘟病、农艺性状好的单株进行分子标记检测，检测结果带有低谷蛋白基因型的单株24株，按单株收获种子。2016年济南正季分别种植BC4F2群体，每个群体种植500株，在每个群体中挑选生育期适中、抗病性好、农艺性状优、丰产性好的单株进行分子标记检测，得到目标单株10个。同年海南种植10个BC4F3家系，每个家系30株，挑选出稻瘟病抗性好、农艺性状较好、低谷蛋白基因型纯合的家系4个，按单株收获种子，每个家系20个单株。2017年正季济南种植BC4F4家系80个，每个家系50株，根据生育期、抗病性、一致性及农艺性状等因素进行选择，挑选其中的3号家系（田间编号17F2J3）进行基因型验证、种子全蛋白SDS-PAGE分析。最终选育出一个低谷蛋白、农艺性状优异且适宜黄淮稻区种植的水稻新品种（图1）。

2.2 低谷蛋白基因的PCR检测

在新品种选育过程中，从BC1F1代开始，每个世代均用 InDel-Lgc1-1 和 InDel-Lgc1-2 两对标记对各单株进行PCR扩增，所有材料均可扩增出一条509 bp条带，只有携带LGC-1基因的单株可扩增出一条881 bp条带。如图2所示，在23个BC1F1单株中，共检测到8个带有低谷蛋白基因型的单株（单株11条带较弱，未统计），根据生育期、农艺性状选择其中的5株进行回交，构建BC2F1群体。后续试验与之相似。对2017年中选家系17F2J3中的6个单株进行PCR扩增，结果表明，家系中6个单株和HNG1均扩增出低谷蛋白基因型带型，而圣稻735表现正常谷蛋白基因型带型 （图3） 。利用新开发的高分辨熔解曲线技术（high-resolution melting curve，HRM）检测圣稻735、HNG1和17F2J3家系中的6个单株，检测结果与PCR扩增的一致（图4）。

2.3 种子总蛋白SDS-PAGE分析

种子总蛋白的 SDS-PAGE 分析表明，17F2J3家系中6个单株及HNG1 成熟谷蛋白的酸性亚基（ 37～39 kD）和碱性亚基（ 22～23 kD） 含量明显低于圣稻735（图5） 。经软件分析，圣稻735、HNG1和17F2J3中谷蛋白占总蛋白的比例分别为71.99%、31.76%和32.27%（表1）。经农业部稻米及制品质量监督检验测试中心测得圣稻735、HNG1和17F2J3的总蛋白质含量分别为7.9%、7.2%和7.5%。因此，推算出圣稻735、HNG1和17F2J3的谷蛋白含量分别为5.69%红色峰图为圣稻735，绿色峰图为HNG1及17F2J3家系中的6个单株。

2.4 低谷蛋白新品系农艺性状调查

17F2J3是从BC4F4家系中选出的一个低谷蛋白基因型纯合且农艺性状优异的家系（如图6）。该材料的株型、剑叶形态与圣稻735相近，株高稍低（与HNG1相近），千粒重稍小，抽穗期比圣稻735提前4～5 d，生育期150 d左右；分蘖、穗长、一次枝梗、二次枝梗、穗粒数、粒长、粒宽等农艺性状与圣稻735无显著差异，见表2。

3 讨论与结论

谷蛋白是水稻种子中的主要贮藏蛋白，也是能被人体消化吸收的主要蛋白。随着生活水平的提高，肾脏病患者人数逐年上升，据中国肾脏病流行病学调查显示，我国慢性肾脏病患者约有 1.2×108，发病率已达 10.8%。由于慢性肾脏病患者在蛋白质代谢方面存在障碍，需要对蛋白质的摄入进行严格控制，普通大米中富含的谷蛋白会加重其肾脏负担，加速肾脏功能的衰退。因此，培育低谷蛋白水稻新品种，替代普通大米作为主食，降低大米中植物蛋白摄入量，可减少血液中的氮素滞留，减轻肾脏的负担，从而延缓慢性肾功能衰竭的进程，提高生存质量。

日本学者最早选育出一个低谷蛋白水稻品种LGC-1，其谷蛋白含量低于4%，肾脏病患者长期食用LGC-1大米，其病情得到显著改善[7]。圣稻735是山东省水稻研究所培育的优良食味水稻新品系，具有早生快发、耐密植、肥水利用率高等特点，适宜在鲁南、鲁西南作麦茬稻种植，在鲁北作一季春稻种植。本研究引进了江苏省农业科学院利用LGC-1创制的低谷蛋白新品系2054，将其与圣稻735杂交，经过4次回交和3次自交以及生育期、抗病性、农艺性状筛选，并结合分子标记选择，于2017年选育出1个农艺性状优良、抗病性强的低谷蛋白水稻新品种17F2J3。经基因型检测、蛋白SDS-PAGE分析、总蛋白测定，其谷蛋白含量顯著低于背景亲本圣稻735，与HNG1相当。本研究在实施过程中紧盯材料低谷蛋白特性，同时根据农艺性状、抗性指标进行综合选择，选育出的新品种穗长、单株有效穗数、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗粒数、结实率、粒长、粒宽、千粒重等性状与圣稻735无显著差异；株高降低，其抗倒伏能力较圣稻735增强。新品种17F2J3为适合黄淮稻区种植的低谷蛋白高产水稻新品种。

本研究后期利用了新开发的HRM技术检测单株基因型，该技术具有操作便捷、快速等优点，适合分离材料大规模筛选。利用该方法，可将 “先种后检”试验模式转变为“先检后种”模式，在早期世代（如回交1次）利用大的分离群体进行基因选择，筛选出带有目标基因的单株种植成群体，从中挑选抗性好、熟期适中、产量潜力突出的单株，然后按株系种植，通过扩大群体，加大得到优良单株的概率，从而缩短育种周期，加快新品种培育进程。这为今后水稻分子育种提供了新的思路。

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