一株产广谱细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

赵天宇，郭一柯，刘霁逸，庞茂达

（1.金陵中学，江苏南京210005；2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，江苏南京210014；3.江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，江苏南京210014）

细菌素（bacteriocin）是某些细菌由核糖体途径合成的具有抗菌活性的多肽或蛋白质。大多数细菌素具有高效、无毒、无抗药性、无副作用、无残留、热稳定好、不影响食品风味等优点。由于乳酸菌是“公认安全”的菌株，使得乳酸菌细菌素在食品保鲜上的应用受到广泛关注[1]。越来越多的研究表明，乳酸菌及其代谢产物细菌素对奶制品、面包、肉制品、水产品等多种食品均有良好的保鲜效果[2]。乳酸链球菌素（nisin）是目前研究最多的乳酸菌细菌素，在50多个国家和地区广泛应用于食品工业[3]。此外，促肠活动素AS-48、米酒乳杆菌素P、植物乳杆菌素163等细菌素也因能抑制腐败菌和食源性致病菌等微生物的生长，显示出很好的应用潜力[4-6]。但是目前商品化的细菌素防腐剂仍然较少，Nisin是被美国食品药品监督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）认可的唯一作为食品防腐剂的细菌素，也是我国批准使用的唯一细菌素防腐剂[7]。在欧洲，商品化的细菌素也只有尼尔斯克公司（Danisco）的Nisin和奎斯特公司（Quest）生产的片球菌素PA-1[8]。

已报道的细菌素大多数抗菌谱较窄，对革兰氏阴性菌抑菌效果较差，这大大限制了其在食品工业中的应用。因此，筛选广谱高效的细菌素具有更广阔的应用前景，已成为现在关注的热点。我国传统发酵食品种类多样，为研究人员筛选抑菌谱广、抑菌活性强的细菌素产生菌提供了很好的条件。本文以不动杆菌、热杀索丝菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌为指示菌，从传统酸白菜中筛选出1株产广谱细菌素的乳酸菌，通过传统生理生化方法和分子生物学方法，对其进行菌种鉴定，并研究了细菌素部分生物学性质和抑菌谱，为乳酸菌细菌素的商业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品

传统酸白菜：沈阳裕丰腌菜厂。

1.2 指示菌

革兰氏阳性菌：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）AS1.1846、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）CMCC 63202、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）ATCC 11509、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19114、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC 28000、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923。

革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、荧光假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AS 1.2620、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）CICC 21527、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC 51005。

试验所用菌株均为江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所畜产品污染监测及预防研究室保存。

1.3 试剂

MRS培养基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、柠檬酸二铵2.0 g/L、乙酸钠5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、MgSO4·H2O0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、吐温-80 1.0 mL，蒸馏水 1 L，调节 pH 值至6.2±0.2，7×104Pa灭菌 20 min；LB 培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、pH 7.0±0.2，1×105Pa灭菌 15 min；胰蛋白酶（2 500 units/mg）、蛋白酶 K（30 units/mg）、木瓜蛋白酶（2 400 units/mg）、胃蛋白酶（2 000 units/mg）；以上试剂均为国产分析纯级，购自南京鼎思生物技术有限公司。

革兰氏染色试剂盒：杭州百思生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒：美国Omega公司；Taq DNA聚合酶、GelExtractionKit：南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.4 乳酸菌的分离纯化

无菌镊子取25 g酸菜样品接种到含100 mL生理盐水的三角瓶中，振荡培养30 min。采用常规的稀释涂布法分离乳酸菌。样品用无菌生理盐水10倍倍比稀释，取 10-3、10-4、10-5梯度的样品各 100 μL 涂布于MRS固体培养基，30℃培养48 h。随机挑取不同的菌落，在MRS固体培养基上划线培养，以得到形态单一的单菌落。

1.5 产细菌素乳酸菌的初筛

分离纯化得到的乳酸菌在MRS中传代培养2次，10 000×g离心10 min，收集发酵上清液。以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌为指示菌，通过琼脂扩散法筛选具有抑菌活性的乳酸菌[9]。具体方法如下：取1 mL培养至对数期的指示菌，接种于100 mL冷却至50℃左右的LB固体培养基，混匀后倒入直径为20 cm的无菌平板，制成带指示菌的固体培养基。用孔径10 mm的打孔器打孔，每孔加入100 μL发酵上清液。37℃培养8 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。选取抑菌圈直径大于13 mm的乳酸菌进行复筛。

1.6 产细菌素乳酸菌的复筛

以革兰氏阳性菌如蜡样芽孢杆菌、热杀索丝菌，革兰氏阴性菌如大肠杆菌、鲍氏不动杆菌为指示菌进一步筛选具有广谱抗菌活性的菌株。选取初筛结果为阳性的菌株进行发酵。为了排除H2O2和有机酸的干扰，发酵后上清液用过氧化氢酶处理，并用5 mol/L NaOH将发酵上清的pH值调至5.5。抑菌平板用打孔器打孔，每孔加入100 μL发酵上清液。37℃培养8 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.7 乳酸菌的鉴定

根据形态学、生理生化特征以及分子生物学对细菌素产生菌株进行菌种鉴定。形态学鉴定是通过观察培养基上生长的菌落形态和革兰氏染色后的菌体特征进行；理化特性分析主要以过氧化氢酶试验、生长温度试验和糖发酵试验为主，试验方法和结果分析参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[10]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[11]。分子生物学鉴定通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对菌株16S rRNA基因进行扩增。

16S rRNA基因扩增引物序列：上游AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游 GGTTACCTT GTTACGACTT，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反应体系（50 μL）：2×PCR Mix 25 μL；10 μmol/L 上、下游引物各2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72℃10 min。PCR产物回收后测序，测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的GenBank序列数据库进行 BLAST分析[12]。

1.8 细菌素性质的初步研究

1.8.1 细菌素的蛋白酶敏感性

将发酵上清分别用1.0 mg/mL的胰蛋白酶[pH 7.5，10 mmol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）]、蛋白酶 K（pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl）、木瓜蛋白酶（pH 7.5，10 mmol/L PBS）和胃蛋白酶（pH 2.0，0.1 mol/L HCl）进行处理，37℃温育30 min后，100℃加热5 min终止反应[13]。随后将样品调节至初始pH 3.8，测定抑菌活性，以未加入酶的发酵上清液作对照，指示菌为蜡样芽孢杆菌。

1.8.2 细菌素的热稳定性

菌株发酵上清液分别在60、80、100、121℃下处理30 min，冷却后用琼脂扩散法进行抑菌试验。以未加热的发酵上清液作为对照。

1.8.3 细菌素的pH值稳定性

用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节发酵上清液pH值为2～8，37℃静置30 min，用琼脂扩散法进行抑菌试验。以未调节pH值的发酵上清（pH 3.8）为对照。

1.9 抑菌谱的测定

以蜡样芽孢杆菌AS1.1846、短小芽孢杆菌CMCC 63202、热杀索丝菌ATCC 11509、单增李斯特菌ATCC 19114、藤黄微球菌CMCC 28000、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠杆菌ATCC 25922、鲍氏不动杆菌、荧光假单胞菌AS 1.2620、肠炎沙门氏菌CICC 21527、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 51005为指示菌，排除酸性物质的干扰后进行抑菌试验，37℃静置培养8 h，游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.10 数据处理与分析

试验重复3次，数据用SPSS 21.0软件进行处理分析，结果以平均数±标准差（M±SD）表示。用Graphpad Prism 7.0软件绘制图片。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离和筛选

采用琼脂扩散法筛选产细菌素的乳酸菌，从208株分离得到的乳酸菌中初筛得到83株对大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌有抑菌活性的乳酸菌。为排除H2O2和有机酸的干扰，复筛时在发酵上清液加入过氧化氢酶，并将pH值调节至5.5。复筛后得到5株对蜡样芽孢杆菌、热杀索丝菌、大肠杆菌和鲍氏不动杆菌均有抑菌效果的乳酸菌，从中挑选抑菌活性最好的5号菌株（命名为SY5）进行后续的研究。SY5对4种指示菌的抑菌圈大小见图1。

2.2 乳酸菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

菌株SY5在MRS培养基上生长良好，呈乳白色、凸起、边缘整齐、表面光滑的小菌落如图2A。革兰氏染色后镜检为蓝紫色，无鞭毛和芽孢，显示为革兰氏阳性短杆菌如图2B。

图1 菌株SY5对4种指示菌的抑菌圈Fig.1 The inhibition zone sizes of strain SY5 against four indicator bacteria

图2 菌株SY5的菌落形态和革兰氏染色镜检图Fig.2 Colony morphology and Gram staining of strain SY5

2.2.2 生理生化鉴定

菌株SY5过氧化氢酶阴性，能在15℃生长，不能在45℃生长，发酵葡萄糖但不产气，这些特征说明SY5属于同型发酵乳酸菌。糖发酵试验结果如表1所示，菌株SY5发酵木糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、核糖、葡萄糖，不发酵阿拉伯糖和鼠李糖，根据伯杰氏细菌鉴定手册，菌株SY5应属戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）。

表1 菌株SY5的糖发酵试验结果Table 1 Results of sugar fermentation experiment of strain SY5

2.2.3 分子生物学鉴定

利用16S rRNA基因引物对菌株SY5基因组进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳得到一条1 500 bp左右的条带见图3。

图3 16S rRNA基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified products of 16S rRNA gene

测序结果拼接后序列大小为1 428 bp，与NCBI数据库中核酸数据进行比对，发现该菌株的16S rRNA基因与戊糖乳杆菌LBa相似性为100%。结合以上生理生化和分子生物学鉴定结果，确定该菌株为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）。

2.3 乳酸菌细菌素性质分析

乳酸菌发酵上清液经蛋白酶作用后的抑菌效果见表2。

由表2可知，经胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后，戊糖乳杆菌SY5发酵上清抑菌效果明显下降，特别是胃蛋白酶和蛋白酶K处理后使其完全失去抑菌活性，由此可见，戊糖乳杆菌SY5发酵上清的抑菌物质具有蛋白质的性质。由于试验设计上排除了有机酸和过氧化氢等的干扰，可确定此抑菌物质是一种细菌素。

残留的抑菌活性如表2所示，戊糖乳杆菌SY5上清液经不同温度处理后，随着作用温度的升高，细菌素的抑菌活性有所下降，但在60℃30 min后，仍然保留90%以上的抑菌活性。121℃处理30 min后，也依然保留82.7%的抑菌活性，说明戊糖乳杆菌SY5产生的细菌素具有很好的热稳定性。

戊糖乳杆菌SY5产生的细菌素pH稳定性如图4所示。

图4 细菌素的pH值稳定性Fig.4 pH stability of bacteriocin

该细菌素在pH＜4.0的酸性条件下有很好的抑菌活性；pH＞4.0以后，随着pH值的增加，抑菌活性不断减弱；pH＞8.0以后，抑菌活性基本消失。

2.4 抑菌谱的测定

戊糖乳杆菌SY5细菌素的抑菌谱见表3。

表3 戊糖乳杆菌SY5细菌素的抑菌谱Table 3 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus pentosus SY5 bacteriocin

如表3所示，戊糖乳杆菌SY5对革兰氏阳性菌如蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、藤黄微球菌的有明显的抑制效果，抑菌圈直径大于18 mm；对短小芽孢杆菌、热杀索丝菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、肠炎沙门氏菌的抑菌效果相当，抑菌圈直径在13 mm～17 mm；对荧光假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈小于13 mm。整体而言，戊糖乳杆菌SY5对革兰氏阳性菌的抑制效果优于对革兰氏阴性菌。

3 结论与讨论

近年来，利用乳酸菌及其代谢产物细菌素对食品中腐败菌和致病菌的抑制作用，来延长食品贮存期、加强食品安全的生物保藏法逐渐被重视。绝大多数的乳酸菌细菌素如nisin只对亲缘关系较近的革兰氏阳性菌有较好的抑菌效果，大大限制了其在食品工业中的应用。因此筛选得到对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果的细菌素就显得非常重要。酸菜发酵是一个由乳酸菌主导的过程，其中以肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为最主要的优势菌种，因此发酵酸菜是筛选乳酸菌的天然材料。Zhao等[14]从东北萝卜泡菜中筛选出1株具有抑制多种G+菌及G-菌的广谱抑菌活性的植物乳杆菌。奎梦漪等[15]从云南自然发酵酸菜液中分离出12株乳酸菌，4株性状优良的乳酸菌经鉴定后为植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌。

本试验利用琼脂扩散法从传统酸菜中分离出一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌SY5，经鉴定为戊糖乳杆菌。戊糖乳杆菌最初被鉴定为植物乳杆菌，随着分子生物学的发展，利用rec A基因和发酵戊糖的性质将其单独划分为戊糖乳杆菌。由于具有特殊的抗菌和调节免疫功能等益生性质，戊糖乳杆菌在乳制品、发酵谷物蔬菜和发酵肉制品等中广泛存在，同时在功能性食品的开发中也发挥重要作用[16-17]。研究发现，SY5能够产生具有热稳定性和酸稳定性的细菌素，对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌等条件致病菌，以及热杀索丝菌和鲍氏不动杆菌等常见的肉制品腐败菌都有很好的抑制效果，属于广谱的细菌素。与目前已知的大多细菌素一样，具有蛋白酶敏感性。这种性质保证了细菌素在经食物进入人体后，容易被体内的蛋白酶降解，不会对机体带来危害[18]。由于乳酸菌在发酵过程中不仅产生细菌素，还会产生具有抑菌活性的乳酸等有机酸。因此，复筛时在发酵上清液加入过氧化氢酶，并把pH值调节到5.5，以排除H2O2和有机酸的干扰。热稳定性试验表明，该细菌素121℃处理30 min后，依然保留80%以上的抑菌活性，适合应用于食品加工和贮藏过程，这与已报道的 sakacin C2[19]、ent35-MccV[20]等细菌素性质相同。此外，该细菌素具有耐酸不耐碱的性质，适合在酸性食品中应用。

综上，本文从传统酸菜中分离出一株具有广谱抑菌活性的戊糖乳杆菌，在食品防腐等方面具有潜在的应用价值。未来的研究集中在分离纯化出戊糖乳杆菌SY5产生的细菌素，并进行结构鉴定和抑菌机制探究，为其应用提供理论基础。