同位素内标法测定鸡蛋中金刚烷胺残留

杨修镇 张呈军 刘少宁 陈玲 牛华星 尹伶灵

（山东省兽药质量检验所 山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室 山东 济南 250022）

金刚烷胺是用于抑制人类流感病毒的药物，它可以抑制病毒穿入宿主细胞，并影响病毒的脱壳[1]，被列为流感防治国家储备药品。在畜牧养殖上金刚烷胺曾主要用于鸡禽流感的预防和早期治疗[2]，由于其移植兽用后缺乏有效的动物安全试验数据，人食用带有金刚烷胺残留的动物产品后易产生具有良好遗传特性可在人与人之间传播的耐药流感毒株[3]，我国农业部2005年发布560号公告明令禁止金刚烷胺等抗病毒药物用于畜禽养殖业[4]。我国目前没有抗病毒药物替代产品，违规使用金刚烷胺的现象仍偶有发生，本文在总结前人工作的基础上，采用同位素内标法对鸡蛋中金刚烷胺残留检测方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串联质谱仪、电子天平(感量0.01g、0.00001g)、均质机、涡旋混合器、离心机(转速8000r/min)、氮吹仪、有机滤膜(0.22µm)，金刚烷胺标准品(sigma公司，含量≥98%)；D6-金刚烷胺标准品(sigma公司，含量≥98%)；生鲜鸡蛋(购于超市)，冰乙酸为优级纯，甲醇、乙腈、甲酸、正己烷为色谱纯；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制 精密称取金刚烷胺标准品和D6-金刚烷胺标准品各10mg，分置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度各为1mg/ml的标准贮备液。分别精密量取金刚烷胺贮备液和D6-金刚烷胺贮备液各100µl，分置100ml容量瓶中，用20%乙腈水溶液稀释至刻度，配制成浓度各为1µg/ml的标准工作液。

1.2.2 样品前处理 称取试料2.0±0.05g(精确至0.01g)置50ml离心管中，加入1µg/ml D6-金刚烷胺标准工作液20µl，再加入1%乙酸乙腈溶液10ml，涡旋2min，8000r/min离心5min，上清液转入另一50ml离心管中，重复提取一次，合并两次上清液，备用。备用液中加入无水硫酸钠3g，正己烷10ml，涡旋1min，8000r/min离心5min，弃去正己烷层，剩余溶液转至另一50ml离心管中，40℃水浴氮吹至干，用1.0ml20%乙腈水溶液溶解残渣，转移至10ml离心管中，加入正己烷2ml，涡旋1min，8000 r/min离心5min，取下层溶液，滤过，供上机测定。

1.2.3 测定方法 （1）色谱条件：色谱柱：C1850mm×2.1mm，粒径1.7µm；流动相：A相为0.1%甲酸甲醇溶液，B相为0.1%甲酸水溶液；；流速：0.3ml/min；进样量：5µL。柱温：35℃；洗脱条件如表1。（2）质谱条件：电离模式：电喷雾正离子(ESI+)，毛细管电压：3v，离子源温度：150℃，脱溶剂温度：350℃，脱溶剂气流速：550L/h.，脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮，采集方式：多反应监测(MRM)，金刚烷胺的定性、定量离子见表2。（3）标准曲线绘制：配制金刚烷胺浓度为2、4、10、20、100、200ng/ml的系列标准溶液，其中内标D6-金刚烷胺浓度均为20ng/ml，注入高效液相色谱－串联质谱仪测定后，以标准溶液中金刚烷胺峰面积和D6-金刚烷胺峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中相应金刚烷胺浓度与D6-金刚烷胺的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线。（4）方法的专属性：按照样品前处理条件的要求进行空白试验、空白添加试验，采用完全相同的步骤进行平行操作，在规定的测试条件下进行检测，确认空白中没有干扰定量的色谱峰。（5）方法的灵敏度：在空白鸡蛋中添加金刚烷胺标准溶液，按确定的前处理方法处理后，经高效液相色谱－串联质谱仪检测，计算信噪比。所有离子色谱峰的信噪比(S/N)满足在3∶1以上且离子丰度比满足要求(见表3)的最低添加量为本方法的检出限。大于检出限，定量离子色谱峰的信噪比(S/N)满足在10∶1以上且回收率满足要求的最低添加量为本方法的定量限。（6）方法的准确度和精密度：采用标准添加法，取3批空白试料，每批中添加金刚烷胺3µg/kg、6µg/kg、30µg/kg 3个不同浓度，每个浓度进行5份，按确定的前处理方法处理后，经高效液相色谱－串联质谱仪检测，计算回收率，求批内、批间相对标准偏差。

表1 流动相梯度洗脱条件

表2 金刚烷胺、D6-金刚烷胺特征离子参考质谱条件

表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 (%)

2 结果

2.1 标准曲线

按照上述系列标准溶液进行线性回归，得回归方程为：y=2.1727x+0.071，曲线的R2为0.9998，在2～200ng/ml浓度范围内呈良好的线性关系，见图1。

图1 标准曲线图

2.2 专属性

添加样品色谱图在标准品相应位置出相同的色谱峰，空白样品无干扰，色谱图见图2～4。

图2 标准品特征离子质量色谱图

图3 鸡蛋空白样品特征离子质量色谱图

图4 鸡蛋空白添加金刚烷胺特征离子质量色谱图

2.3 灵敏度

本方法检出限为1µg/kg，定量限为3µg/kg。

2.4 准确度和精密度

在空白鸡蛋中添加3个不同浓度的金刚烷胺进行回收率试验，结果见表4。可见回收率为87.48%～98.15%，批内、批间相对标准偏差均小于5%。

表4 鸡蛋中金刚烷胺的添加回收率实验结果 (µg/kg、%)

3 讨论与小结

（1）文献报道的鸡蛋中金刚烷胺的残留检测方法主要为液相色谱－串联质谱法，该方法具有高效分离和多组分定性、定量的优点。林涛[5]等采用氨水－乙腈提取，C18和NH2填料进行分散固相萃取净化；艾连峰[1]等采用甲醇－1%三氯乙酸或乙腈提取，阳离子交换在线净化柱(Cyclone MCX)净化；吴银良[2]等采用乙酸乙腈提取，PSA和C18填料进行分散固相萃取净化；本研究采用1%乙酸乙腈提取，正己烷液液分配去脂净化更为简单，检验成本更为低廉。（2）齐刚[3]等以乙腈－0.2%甲酸水为流动相梯度洗脱；尹晖[6]等以0.1%甲酸乙腈－0.1甲酸水为流动相梯度洗脱，本文选择0.1%甲酸甲醇溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相A作比较，发现以0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，其特征离子质量色谱图的峰形和分离度不如用0.1%甲酸甲醇溶液做流动相好，最终选择了0.1%甲酸甲醇溶液为流动相A。（3）汤晓艳[7]等以氯苯那敏为内标对鸡蛋中金刚烷胺残留进行定量，氯苯那敏又名扑尔敏，抗组胺类药，主要用于鼻炎、皮肤黏膜过敏及缓解流泪、打喷嚏、流涕等感冒症状。存在氯苯那敏与金刚烷胺联用治疗禽流感的可能，因此金刚烷胺为阳性的样品同时存在氯苯那敏残留的可能也是存在的，以氯苯那敏为内标测定金刚烷胺存在相当的定量风险。本研究采用金刚烷胺同位素D6-金刚烷胺为内标避免了定量风险，且定量更为准确。

本文建立的鸡蛋中金刚烷胺的残留检测方法，前处理方法简便；串联质谱法检测定性准确；同位素内标法定量准确度高、重复性好；检出限为1µg/kg灵敏度度高，适用于鸡蛋中金刚烷胺残留量的检测。