自拟板柴口服液质量标准改善的研究＊

郝 哲，张建帮，李晓明，王丽军，刘 栋，程艳芹，李明春

［作者单位］450042河南郑州，原解放军153医院制剂室（郝哲，张建帮，李晓明，王丽军，刘栋）；266071山东青岛，原解放军401医院制剂室（程艳芹，李明春）

板柴口服液来源于笔者所在医院临床经验方，由板蓝根、柴胡、金银花、大青叶和鱼腥草组成，具有清热解毒、疏散风热、利咽消肿的功效，用于感冒发热、咽喉肿痛等症。板蓝根是传统的抗病毒中药之一，作为方中主药，很好地发挥了其清热解毒的功效。现代药理研究表明，板蓝根中的（R，S）－告依春有明显的抗流感病毒作用［1］，是板蓝根抗病毒的代表性有效成分之一，也是反映板蓝根药材质量的一个重要指标［2］。原标准仅采用薄层色谱法对板蓝根和柴胡进行定性鉴别，标准相对滞后，为进一步有效控制该制剂的内在质量，该实验优化了薄层色谱条件，对板蓝根、大青叶和柴胡3种药材进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法对该制剂中R，S－告依春进行含量测定，该次研究拟为军队医院制剂质量标准提升迈入一个新台阶提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC－10A高效液相色谱仪；BT－125D型电子天平（赛多利斯有限公司）；KQ－50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药柴胡皂苷a对照品 （批号110777－201108，含量为90.5%）；靛玉红对照品 （批号110717－200204）；R，S－ 告 依 春 对 照 品 （ 批 号111753－201304，含量为 99.9%）；柴胡对照药材（批号 120992－201108）； 大青叶对照 药 材 （批 号121367－200602）； 板蓝根对照药材 （批号121177－201306），均购于中国食品药品检定研究院。板柴口服液 （中国人民解放军第一五三中心医院自制，批号：150312，150327，150506）；阴性样品自制；甲醇为色谱纯（天津四友），水为自制蒸馏水，其他试剂均为分析纯。硅胶G薄层板（上海海洋化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 柴胡的 TLC 鉴别［3－5］取本品 10 ml，加水20 ml，用水饱和的正丁醇萃取2次，30 ml/次，合并正丁醇液，用氨试液30 ml洗涤1次，取正丁醇层，蒸干，残渣加乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取不含柴胡的阴性样品10 ml，同法制成阴性对照溶液。再取柴胡皂苷a对照品适量，加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取柴胡对照药材 0.2 g，加乙醇 5 ml，超声 10 min，滤过，作为柴胡对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》四部通则0502（2015年版）吸取供试品溶液和阴性对照溶液各 10 μl，对照品溶液及对照药材溶液各 5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－乙醇－水（8∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛40%硫酸溶液，60℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的红色斑点，阴性对照无干扰。结果见图1。

图 1 柴胡的薄层鉴别图

2.1.2 板蓝根、 大青叶的TLC鉴别［6－9］取本品30 ml，用二氯甲烷萃取2次，30 ml/次，合并二氯甲烷液，用1%NaOH溶液洗涤2次，20 ml/次，取二氯甲烷层，浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。另取不含板蓝根、大青叶的阴性样品30 ml，同法制成阴性对照溶液。再取大青叶对照药材0.2 g，加二氯甲烷5 ml，超声20 min，滤过，即得大青叶对照药材溶液；再取板蓝根对照药材5 g，加乙酸乙酯50 ml，回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷0.5 ml使溶解，即得板蓝根对照药材溶液。另取靛玉红对照品，加二氯甲烷制成每1 ml含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法《中国药典》四部通则0502（2015年版）吸取上述七种溶液各 10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯（3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的红色斑点，阴性对照无干扰。结果见图2。

图 2 板蓝根、大青叶的薄层鉴别

2.2 R，S-告依春含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性试验［6］采用HPLC法，色谱柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇－0.02%磷酸溶液（7∶93）；流速 1 ml/min；检测波长245 nm；柱温30℃；进样量10 μl。理论塔板数按R，S－告依春峰计算应不低于3000。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取板柴口服液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 取R，S－告依春对照品10.26 mg，精密称定，至100 ml量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，得浓度为0.1025 mg/ml的对照品储备液。精密吸取对照品储备液4.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得41.00 μg/ml的对照品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺板蓝根的阴性样品5 ml，按照2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.2.5 系统适应性试验 吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，分别按上述色谱条件测定，记录色谱峰。结果样品峰与其他组分良好分离，阴性样品无干扰。结果见图3。

2.2.6 线性关系考察 精密吸取R，S－告依春对照品储备溶液（0.1025 mg/ml）1 ml，2 ml，4 ml，6 ml，8 ml置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，吸取10 μl注入色谱仪，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度 μg/ml（X）为横坐标，绘制标准曲线，得 R，S－告依春回归方程为：Y=72227X－39176，r=0.9999 （n=5）。结果表明，R，S－告依春在 10.25～82 μg/ml范围内有良好的线性关系。

图 3 R，S-告依春HPLC图

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μl，重复进样 6 次，记录峰面积，结果 R，S－告依春峰面积的RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批次样品 （批号：150312）6份，按2.2.2项下制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，记录峰面积。按外标法以峰面积计算含量，结果样品中R，S－告依春平均含量为63.18 μg/ml，RSD为0.81%，表明方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 取2.2.8项下1号供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件，分别在 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h进行测定，记录峰面积。结果R，S－告依春峰面积的RSD为1.04%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品9份各2.5 ml，分别精密加入R，S－告依春对照品溶液（41.00 μg/ml），3.0 ml，3.8 ml，4.6 ml，各平行 3份；按2.2.2项下方法制备供试品溶液并进行测定，计算回收率，结果见表1。

2.2.11 含量测定 取3批板柴口服液 （批号分别为 150312，150327，150506）， 每批各 3 份， 按照2.2.2项下制备供试品溶液，依法进行含量测定。由表2见，三批板柴口服液中R，S－告依春含量的均值为62.43 μg/ml，取其80%作为本标准的含量下限，为 49.94 μg/ml，即每 1 ml板柴口服液中含 R，S－告依春以（C5H7NOS）计，不得少于 49 μg。

3 讨论

薄层色谱研究中，避免使用对人体及环境有害的三氯甲烷等试剂，所选试剂有利于环保。查阅大量文献［6－8］，鉴别板蓝根时多选用精氨酸作为对照品，但经研究发现，板蓝根，柴胡，大青叶三者均含有精氨酸，专属性不强。曾尝试对该制剂中R，S－告依春进行薄层鉴别，但展开效果不理想。板蓝根和大青叶来源于同一植物的不同部位，经多次试验，二者均含有靛玉红［9，10］，最终选择靛玉红作为对照品，来鉴别二者。因板蓝根为方中主药，故保留此鉴别方法。曾对该制剂中臣药金银花和鱼腥草进行薄层鉴别，因二者均含有绿原酸［11，12］，阴性互相干扰，未采用。

在R，S－告依春含量测定中，有文献报道，以水为提取溶剂［13］，该文比较了甲醇、乙醇、水 3种溶剂，结果三者提取率相差不多，但以水为溶剂，杂质峰较多，基线不稳，而以甲醇为溶剂提取，可醇沉除去部分杂质，杂质峰较少，基线更为平稳，主峰分离度更好，故选择甲醇为提取溶剂。该课题组曾对本制剂中绿原酸进行了含量测定研究［11，12］，但经过长期稳定性试验，该制剂在放置6个月后，绿原酸含量明显下降，原因是绿原酸不稳定易分解，故未纳入质量标准。

表 1 R，S-告依春加样回收试验（n=9）

表 2 三批样品的含量测定结果

在制定质量标准时，应考虑有效成分转移率的问题，一般以＞30%为宜。如果转移率太低，由于中药材质量参差不齐，可能会导致制剂中有时无法测到该成分或者含量达不到所定标准。在该试验中，三批样品R，S－告依春的转移率分别为53.4%；50.8%；54.7%，生产工艺稳定可行，故选取该成分纳入质量标准。

综上所述，该实验建立的R，S－告依春HPLC含量测定方法，简便易行，灵敏度高，重复性好，可用于本制剂的质量控制。