中药与庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶耐药重组菌的作用研究

陈 琳， 管远红， 黄东璋， 齐富刚， 张洪涛， 陈冬冬， 区卓麟， 于淼淼，吴怀秀， 杨雨秋， 陈瀛川， 王亚南， 苏哲君， 张 欢

(江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州 225300)

当前，耐药性是临床抗感染治疗面临的严重挑战，抗耐药菌感染已成为全球性临床医学重大难题[1-5]。研究表明，中药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药鲍曼不动杆菌、产超广谱β-内酰胺酶耐药菌均有一定的影响和作用[6-10]。虽然从抗菌效价或抗菌作用强度比较，几乎所有中药的抗菌作用均弱于抗生素[11]，但是由于中药不但可以作用于细菌繁殖的不同阶段及多个代谢环节，中药和西药联用还可以相得益彰，为临床用药提供更多的选择[12]，同时，中药能够从整体上提高机体的免疫功能，减轻感染引起的病理损害，起到非特异性治疗的作用[5]。如熊南燕等报道，体内外无抗菌活性的鱼腥草注射液，对兔体内硫酸庆大霉素注射液抗菌活性有明显增强作用[13]。

笔者所在课题组前期研究中发现，中药黄连、黄芩、五倍子、连翘等对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌有一定的抑制作用，而氨基糖苷类抗生素是治疗革兰氏阴性菌感染的重要药物，由于16S rRNA甲基化酶的出现，导致庆大霉素、阿米卡星等氨基糖苷类抗生素在临床抗革兰氏阴性感染中丧失其作用。因此，本研究拟以构建的16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌为研究对象，研究黄连、五倍子、黄芩等几种中药免煎颗粒联合庆大霉素对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的作用，一方面为临床用药提供依据，另一方面，为16S rRNA甲基化酶耐药菌感染提供更多的治疗用药选择。

1 材料与方法

1.1 菌株

16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌pRmtB1。质控菌E.coliATCC 25922，购自卫生部药品生物制品检定所。

1.2 培养基

水解酪蛋白肉汤(MH Broth)，水解酪蛋白琼脂(MH agar)，购自杭州天和微生物试剂有限公司。红四氮唑，购自扬州科能生物技术有限公司。

1.3 供试药物

黄连颗粒(批号1501140，生药含量3 g)、醋五味子颗粒(批号1502099，生药含量6 g)、连翘颗粒(批号1411052，生药含量10 g)、乌梅颗粒(批号1412062，生药含量10 g)、黄芩炭颗粒(批号1303143，生药含量10 g)、五倍子颗粒(批号1408125，上药含量3 g)，均购自江阴某药业有限公司。硫酸庆大霉素(批号0304，含量590 μg/mg)。

1.4 受试药液的制备及稀释

称取受试中药颗粒，分别用灭菌超纯水溶解成如表1所示的药物浓度，针头滤器过滤后分装，于-20 ℃或-70 ℃冷冻保存备用。

表1 药物贮备液配制浓度

1.5 菌液制备

在MH琼脂平板上挑取pRmtB1单个菌落接种于2～5 mL Muller-Hinton(MH)肉汤管中，37 ℃振荡培养4～8 h，用调节过钙镁离子的MH肉汤稀释菌液，使稀释菌液达到 0.5 麦氏比浊管浊度，再按1 ∶100稀释菌液至含菌量约为 1×106CFU/mL，备用。

1.6 联合用药测定方法

采用棋盘微量稀释法(Checkerboard Microdilution)[14-16]测定2种药的部分抑菌浓度指数(frictional inhibitory concentration index，FICI)。具体操作如下：首先，应用微量稀释法测定2种药物的MIC，作为棋盘稀释法的中心浓度。然后分别以2种药MIC的2、4、8、16倍及1/2、1/4、1/8倍稀释药物。取出无菌的96孔微量细胞培养板，置于超净工作台，向96孔微量细胞培养板的前8行及前8列各孔中加入肉汤稀释好的菌液(1×106CFU/mL )100 μL。然后分别沿纵轴加入不同浓度的甲药50 μL，沿横轴加入不同浓度的B药 50 μL，A药单沿横轴1～7孔分别加入2倍稀释的A药 100 μL，B药单沿纵轴1～7孔分别加入2倍稀释的B药 100 μL，第9列肉汤组只加入肉汤200 μL，第10列菌液组只加入菌液200 μL。加样完毕后，将细胞培养板置于 37 ℃ 培养16～18 h。观察结果前2 h，于细胞培养板的每孔均加入0.5%的红四氮唑溶液5 μL，37 ℃继续培养2 h，分别观察记录2种药单独作用的最低抑菌浓度(MICA及MICB)及联合作用的最低抑菌浓度(MICAB及MICBA)。当第10列菌液对照组的细菌明显生长，呈现红色，第9列肉汤对照组无细菌生长，呈现无色，各试验组小孔内能完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为MIC值(即第1个颜色不变的小孔所对应药物浓度即为MIC)。如出现单一跳孔，则记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如出现多孔跳孔的现象，则必须重新试验。

1.7 联合用药判定标准

按照下列公式计算部分抑菌浓度指数(FICI)，按照表2的判定标准对2种药物的联合作用效果进行评价。

式中：MICA为A药单用时测得的MIC；MICAB为A、B 2种药联用时测得的A药MIC；MICB为B药单用时测得的MIC；MICBA为A、B 2种药联用时测得的B药MIC。

表2 联合用药效果评价判定标准

2 结果与分析

2.1 黄连免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果

表3 黄连与硫酸庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的作用结果

2.2 五倍子免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果

2.3 连翘免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果

表4 五倍子与硫酸庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的作用结果

表5 连翘与硫酸庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的作用结果

2.4 黄芩免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果

表6 黄芩与硫酸庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的作用结果

2.5 乌梅免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果

表7 乌梅与硫酸庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的作用结果

3 讨论

联合用药是增强药物疗效、延缓或减少耐药性产生的一种重要手段和方法。王耘等研究表明，贝母的有效成分贝母素乙联合氨苄西林舒巴坦可逆转细菌对氨苄西林舒巴坦的耐药性，三药联合的体内抗菌作用增强。何明等研究双黄连、清开灵与头孢哌酮联合对产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌所致败血症动物模型的协同抗菌作用发现，双黄连、清开灵与头孢哌酮联合有协同抗菌作用，不但可提高抗生素对耐药菌的疗效，而且能降低抗生素的使用剂量[17-18]。傅瑞春联合应用Kirby纸片扩散法、棋盘稀释法及杀菌曲线法评价大黄素、大黄酸、隐丹参酮等中药有效成分与青霉素、氨苄西林、阿米卡星等多种药物联合对耐药菌的作用，结果显示中药与西药联合后，有的呈现协同作用，有的呈现无关作用，有的呈现相加作用[16]。本研究中，庆大霉素与五倍子联合对耐药重组菌具有协同作用，两者的联合抑菌浓度比单独使用均有所降低，表明五倍子能降低庆大霉素的耐药水平。另外，黄连、乌梅与庆大霉素联合后抑菌效应也有一定的增强，但不如五倍子与庆大霉素的联合效应明显，而黄芩与庆大霉素联合后呈现无关作用。

4 结论

中药五倍子与庆大霉素联合有协同作用，黄连、乌梅与庆大霉素联合有相加作用，连翘与黄芩与庆大霉素联合呈现无关作用。中药五倍子有望成为庆大霉素抗耐药菌感染协同剂。