普瑞巴林对CCI模型大鼠脊髓GFAP和SP表达的影响*

张嘉航 韩立伟 曲静波 周华成 贾雅蕊 刘金锋△

（1哈尔滨医科大学附属第二医院疼痛科，黑龙江麻醉与危重病重点实验室，哈尔滨 150086；2哈尔滨医科大学附属第四医院疼痛科，哈尔滨 150086；3菏泽市立医院麻醉科，菏泽 274000）

2011年，国际疼痛学会 (International Association for the Study of Pain, IASP) 将神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP) 定义更新为由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛[1]，这种疾病在普通人群中的发病率约为3.3%～8.2%[2]，在有些国家神经病理性疼痛患病率已经高达6.9%～10%[3]。长期慢性疼痛不但影响病人的睡眠和生活，还会增加抑郁、焦虑等情感障碍的发病率。目前神经病理性疼痛的临床治疗仍以药物为主，但由于该疾病发生机制复杂、治疗药物及方法缺乏特异性，使得探索神经病理性疼痛的有效治疗措施成为当今医学界亟待攻克的难题之一[4]。

普瑞巴林(pregabalin, PGB)作为一种新型抗癫痫药物，更多研究关注的是其对慢性疼痛的治疗效果。目前已被多个国际指南推荐为治疗神经病理性疼痛的一线药物[5]，临床广泛应用于糖尿病性外周神经痛、带状疱疹后神经痛等疾病的治疗。自2004年普瑞巴林在美国上市以来，关于它治疗神经病理性疼痛的研究越来越多，但时至今日普瑞巴林治疗神经病理性疼痛的作用机制仍尚未完全明确。不断完善普瑞巴林的作用机制，不仅对治疗神经病理性疼痛临床用药方案提供理论基础，而且对于寻找普瑞巴林作用靶点、药物适应症扩充以及药物间相互作用具有重要意义。

近年来，大量研究结果显示星形胶质细胞激活是慢性神经病理性疼痛产生与维持的重要机制之一，胶质细胞的激活机制和功能研究成为神经病理性疼痛研究的一大热点[6]。胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) 的表达是星形胶质细胞激活的标志，反映了星形胶质细胞的功能和状态[7]。P物质 (substance P, SP) 不但可以传递伤害性信息，而且可以调控脊髓星形胶质细胞功能。有研究显示一定浓度的SP能够诱发脊髓星形胶质细胞活化[8]。因此，研究普瑞巴林是否通过SP对脊髓星形胶质细胞的活化产生影响，有助于进一步明确神经病理性疼痛产生与维持的机制，为神经病理性疼痛的临床治疗提供新的思路。

本实验拟通过建立大鼠经典坐骨神经慢性压迫损伤 (chronic constriction injury, CCI) 模型，观察普瑞巴林对模型大鼠脊髓星形胶质细胞GFAP和SP表达的影响，同时结合模型大鼠机械刺激缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期值随时间的变化趋势及镇痛效果，进一步探讨普瑞巴林对神经病理性疼痛的治疗效果及其作用机制，旨在为临床治疗提供理论基础。

方 法

1.实验对象

雄性清洁级SD大鼠 (200～220 g) 由中国北京维通利华动物实验公司提供，实验动物使用许可证SCXK（京）2016 - 0011。实验前饲养于温度光照适宜的动物饲养室内3日，12小时黑/白光照，自由进食饮水。

2.主要仪器及试剂

普瑞巴林（LYRICA,美国辉瑞制药公司）；肝素（浙江万邦医药公司）；多聚甲醛固定液（Paraformaldehyde，Sigma，德国）；GFAP多克隆抗体（湖北武汉博士德公司）；SP多克隆抗体（湖北武汉博士德公司）；二抗（中杉金桥生物技术公司）；七氟烷（上海恒瑞医药）；手术器械：外科手术刀、眼科剪、弯镊、血管钳、缝合针等（均为六六手术器械有限公司，苏州）；光学显微镜（NIKON80i，日本）；Von Frey 纤维丝测痛仪（Stoelting，美国）；热板测痛仪（model YLS-6B，益延科技发展有限公司，山东）；小动物麻醉机（HARVARD公司，美国）。

3.实验动物分组及给药

经痛阈测定后排除痛阈异常的大鼠，最终入选30只健康SD大鼠，采用随机数字表方法分为3组(n= 10)：假手术组 （S组），大鼠仅暴露右侧后肢坐骨神经，不做结扎环，逐层缝合切口；CCI组 （C组），仅建立大鼠CCI模型；普瑞巴林组 （P组），于术后第7 d至第14 d取材止，60 mg/kg普瑞巴林每日一次对CCI模型大鼠灌胃 （溶于4 ml生理盐水中）。S组和C组大鼠灌注同等容积生理盐水。

4.神经病理性疼痛模型的制备

参照Bennett[9]的方法建立大鼠CCI模型：大鼠七氟烷吸入麻醉后左侧卧位固定在操作台上，右侧后肢皮肤去毛备皮消毒，于坐骨结节处切开皮肤，钝性分离各层肌肉，暴露坐骨神经，用4-0的羊肠线打4个松紧合适的结，间距约为1 mm，结扎强度以显微镜下观察神经轻微凹陷但不阻断坐骨神经的血供为宜，术毕逐层缝合肌肉及皮肤并使用碘伏消毒，单笼饲养。

5.行为学测试

观察所有实验大鼠一般情况，包括饮食，生长，毛发色泽，记录大鼠的体重变化。于术前3天连续测定大鼠机械刺激缩足反射痛阈值 (paw withdrawal mechanical threshold, PWMT) 和热刺激缩足反射潜伏期 (paw withdrawal thermal latency, PWTL)，取平均值作为术前基础值。

6.机械刺激缩足反射痛阈值测定(PWMT)

将大鼠置于自制金属网格笼子(18 cm×8 cm×8 cm)中，待大鼠适应环境，梳理和探究活动基本消失、足底伸展适中后，将不同压力的von Frey纤维丝从底部竖直刺激大鼠右后足底中心持续6～8 s，缓慢增加压力，在刺激时间内或在移开von Frey纤维丝时大鼠有抬足、缩足、舔足等动作视为阳性反应。按Chaplan等[10]研究的“ up and down ”方法计算大鼠机械缩足阈值。每只大鼠测3次，每次间隔10 min，取平均值。

7.热刺激缩足反射潜伏期测定 (PWTL)

设定智能热板测痛仪温度为52 ℃，待大鼠适应周围环境后，将大鼠置于热板仪上，记录大鼠受刺激出现迅速抬足或舔足的时间，即为热痛阈值。每只大鼠重复3次，每次间隔时间10 min，取平均值。

8.免疫组化

术后第14天将大鼠麻醉后固定操作台上，仰卧位开胸，暴露大鼠心脏，经心尖左心室插管至升主动脉进行灌注。依次使用4 ℃生理盐水及4%多聚甲醛各250 ml灌注，灌注完毕后，打开椎板迅速将大鼠脊髓L4-L6节段取下，置于10%多聚甲醛中固定48 h后石蜡包埋成块，4 μm连续切片。分别按照GFAP及SP试剂说明进行免疫组化操作，每只大鼠做5张切片。主要步骤为内源性过氧化酶的阻断，热抗原修复，分别加入适当稀释一抗(GFAP 1：400，SP 1：400)，4 ℃孵育过夜，加入二抗，DAB显色并复染。每张切片在200倍光学显微镜下，随机选取3个不同视野观察，用图像分析系统测定脊髓背角GFAP与SP阳性表达的平均光密度值。

9.统计方法

数据采用SPSS 19.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差(±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；重复测量的资料采用重复测量方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.各组大鼠行为学测试结果的比较

S组和P组大鼠生长及饮食情况良好，毛发光亮；C组大鼠生长及饮食较差，但各组大鼠体重比较无明显差异。C组大鼠出现不同程度的右后肢步态跛行，后足悬空，右后足外翻及肌肉萎缩等状态，P组大鼠上述症状明显减轻。

三组大鼠PWMT和PWTL术前基础值比较无统计学差异。S组术后各时间点PWMT和PWTL与术前基础值相比，无明显统计学差异。CCI模型建立后，C组和P组大鼠术后PWMT和PWTL均较术前明显降低，其中C组于术后第7 d最为明显，与S组相比差异显著 (P＜ 0.05)。P组大鼠经普瑞巴林治疗后，术后痛觉过敏逐渐改善，PWMT和PWTL较C组明显提高，差异有统计学意义 (P＜0.05，见图1A，图1B)。

2.脊髓背角GFAP表达的变化

GFAP免疫组化阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色。S组大鼠术后14天脊髓背角GFAP免疫阳性细胞平均光密度较低 (0.33±0.02)，而在C组大鼠术侧脊髓背角GFAP阳性细胞数表达增强，染色加深，平均光密度值 (0.57 ± 0.06) 明显高于S组，差异具有统计学意义 (P＜ 0.05，见图2A, 2B)；与C组相比，P组大鼠脊髓背角GFAP阳性细胞表达下调明显，平均光密度值明显降低 (0.35±0.02)，差异有统计学意义 (P＜ 0.05，见图2A, 2B)。

3.脊髓中SP表达的变化

脊髓SP免疫阳性细胞在光镜下观察为胞浆着色，呈棕黄色的粗颗粒纤维。与S组大鼠脊髓SP平均光密度 (0.25±0.02) 表达相比，C组大鼠脊髓SP平均光密度值 (0.49±0.08) 明显增高 (P＜ 0.05，见图3A，3B)；经普瑞巴林治疗后，P组大鼠脊髓SP平均光密度 (0.29±0.02) 较C组明显下调，差异有统计学意义 (P＜ 0.05，见图3A, 3B)。

讨 论

本实验采用的CCI模型是神经病理性疼痛的国际通用模型，制备简单，对大鼠的损伤较小[9]。实验结果显示术后CCI组PWMT和PWTL明显降低，术后第7 d最为明显。术后应用普瑞巴林60 mg/kg治疗后，CCI模型大鼠的PWMT和PWTL显著增加，痛觉过敏迅速明显缓解且大鼠未出现水肿、嗜睡、运动失调、进食量减少、腹泻等不良反应。

普瑞巴林作为治疗神经病理性疼痛的一线药物，它的治疗机制得到越来越多的关注和研究。作为GABA受体类似物，普瑞巴林能够抑制神经病理性疼痛中电压门控钙离子通道α2δ-1蛋白在脊髓背角的表达，减少钙离子内流，抑制兴奋性神经递质的释放，从而减轻神经损伤后产生的痛觉过敏和自发性疼痛[11]。研究发现普瑞巴林鞘内给药可以抑制脊髓背角广动力范围 (wide dynamic range, WDR)神经元，减轻神经病理性疼痛大鼠痛敏反应[12]；Gustafsson等给予SNI疼痛模型大鼠普瑞巴林口服后，大鼠的痛觉超敏明显减轻[13]；另有研究表明普瑞巴林对该模型大鼠的镇痛效果和持续时间与剂量相关[14]。在临床实验中，大量随机，双盲，对照研究也显示了普瑞巴林对多种中枢性、外周性及癌痛具有良好的镇痛效果[15,16]，弹性剂量150～600 mg/d（视病情调整用量）的普瑞巴林能够有效缓解创伤后神经性疼痛，改善睡眠及病人整体状态且耐受性良好[17]。本实验结果显示术后连续8天给予大鼠60 mg/kg普瑞巴林灌胃，能够显著减轻CCI模型大鼠的痛觉过敏且未出现明显不良反应。这与国内外研究结果相一致，支持了普瑞巴林治疗神经病理性疼痛可靠的有效性和安全性。

图1 (A)三组大鼠不同时间机械刺激缩足反射阈值变化趋势 (g)S，C，P分别为假手术组，CCI模型组，普瑞巴林组 *P ＜ 0.05，与S组比较；#P ＜ 0.05，与C组比较(B)三组大鼠不同时间热刺激缩足反射潜伏期值变化趋势 (s) S，C，P分别为假手术组，CCI模型组，普瑞巴林组*P ＜ 0.05，与S组比较；#P ＜ 0.05，与C组比较Fig.1 (A) Changes of PWMT in three groups at different time points S： sham group, C： CCI model group, P： PGB group *P ＜ 0.05, compared with Group S; #P ＜ 0.05, compared with Group C.S： sham group, C： CCI model group, P： PGB group.(B) Changes of PWTL in three groups at different time points.*P ＜ 0.05, compared with Group S; #P ＜ 0.05, compared with Group C.

图2 三组大鼠脊髓背角中GFAP表达的比较S,C,P分别为假手术组，CCI模型组，普瑞巴林组(A)大鼠脊髓背角GFAP免疫组化图；(B)大鼠脊髓背角GFAP平均光密度值 *P ＜ 0.05，与S组比较； #P ＜ 0.05，与C组比较Fig.2 The expression of GFAP in the spinal dorsal horn in three groups C： CCI model group, P： PGB group (A) Immunohistochemistrical staining of GFAP in the spinal dorsal horn; (B) Mean optical density of GFAP in the spinal dorsal horn.*P ＜ 0.05, compared with group S; #P ＜ 0.05, compared with group C.S： sham group,

图3 三组大鼠脊髓背角中P物质表达的比较S，C，P分别为假手术组，CCI模型组，普瑞巴林组 (A)大鼠脊髓背角P物质免疫组化图；(B)大鼠脊髓背角P物质平均光密度值与S组比较，*P ＜ 0.05；与C组比较，#P ＜ 0.05Fig.3 The expression of SP in the spinal dorsal horn in three groups S： sham group, C： CCI model group, P： PGB group.(A) Immunohistochemistrical staining of SP in the spinal dorsal horn; (B) Mean optical density of SP in the spinal dorsal horn.*P ＜ 0.05, compared with group S; #P ＜ 0.05, compared with group C.

为了研究普瑞巴林镇痛作用的机制，我们进一步观察了普瑞巴林对CCI大鼠脊髓背角GFAP和SP表达的影响。

当外周神经损伤后，初级传入纤维末梢释放的神经递质可以激活脊髓背角星形胶质细胞，进而可引发丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 级联反应，活化ERK、JNK/SAPK、p38通路，导致离子通道表达水平变化继而释放大量细胞因子如白介素-1β (IL-1β)、白介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 等造成中枢敏化，最终产生神经病理性疼痛[18]。研究发现星形胶质细胞在不同的神经病理性疼痛模型中均被激活，而通过给予抑制星形胶质细胞功能的药物如氟代柠檬酸等可以明显减轻这种痛觉过敏现象[19]，这些研究结果提示星形胶质细胞的激活在参与调节神经病理性疼痛的发生和发展过程中起着非常重要的作用。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，也是目前用来识别星形胶质细胞来源应用最为广泛的标志物，其表达可以间接反映星形胶质细胞激活的程度。我们发现术后14天S组大鼠仅有少量GFAP表达，行为学测试无明显痛觉过敏出现。而脊神经损伤后C组大鼠结扎侧脊髓背角内GFAP阳性表达显著上调，痛觉过敏增强，提示脊髓星形胶质细胞被激活参与并维持了外周神经损伤性疼痛的发生过程。连续8天给予P组大鼠60 mg/kg普瑞巴林后，我们发现大鼠术侧脊髓背角细胞内的GFAP表达较C组明显降低，大鼠痛觉过敏程度明显减轻。

SP主要分布于脊髓后角灰质浅层，尤其在伤害性初级传入神经纤维末梢，被释放后能与突触后神经元的受体相结合，参与慢性疼痛在脊髓的传导和调制；研究发现脊髓中的星形胶质细胞在SP的作用下能够明显活化并分泌炎性因子TNF-α、IL-1β，而TNF-α除了增强脊髓内的炎性反应[20]，还可以通过JNK信号传导通路产生中枢敏化趋化因子单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 再次激活星形胶质细胞，活化的星形胶质细胞会合成释放更多的胶质介质，从而引发级联反应，提高神经元兴奋性，导致脊髓水平的中枢敏化，最终产生持续性疼痛[21]。本实验研究显示，C组大鼠神经损伤后大鼠PWMT和PWTL明显下降，脊髓中GFAP表达上调，与此同时脊髓SP表达也增强，这些结果提示高表达的SP参与了神经病理性疼痛的产生与维持；而给予普瑞巴林干预后，P组大鼠在术后第14天脊髓背角SP的表达明显下降，这种变化与GFAP的表达变化及行为学测试结果相一致，由此我们推测普瑞巴林可能通过下调SP的表达来进一步抑制CCI模型大鼠脊髓星形胶质细胞的激活，从而减轻CCI大鼠痛觉过敏，这可能成为普瑞巴林治疗神经病理性疼痛的机制之一。但由于神经病理性疼痛发病机制广泛而复杂，它与脊髓SP、星形胶质细胞以及离子通道表达水平和细胞内信号传递的改变有着密不可分的联系，普瑞巴林通过哪些具体途径抑制脊髓背角SP表达，是否有其它神经活性物质参与调控星形胶质细胞激活仍有待进一步探究。本实验存在一定局限性，并未使用GFAP或SP的抑制剂来进一步观察大鼠痛觉过敏的变化情况，需要后续实验进一步探索和证实。

综上所述，普瑞巴林可以显著抑制CCI模型大鼠的痛觉过敏症状，这种镇痛机制可能与下调脊髓背角SP的表达从而抑制其对星形胶质细胞的激活有关。