四季抗病毒合剂中抑菌剂的抑菌效力观察

高飞，李秋菲，佘凡

(1.榆林市药品检验所，陕西 榆林 719000；2.陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710061；3.杨凌示范区药品检验监测评价中心,陕西 杨凌 712100)

四季抗病毒合剂是由鱼腥草、桔梗、苦杏仁、菊花等11味中药组成,清热解毒、消炎退热。主要用于上呼吸道感染、病毒性感冒、流感等病毒性感染疾患。四季抗病毒合剂为多剂量口服制剂，由于其在使用过程中存在多次打开包装而被污染的风险，需要添加一定量的抑菌剂保证产品的正常储存和使用，避免微生物生长与繁殖[1-3]。如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性(如水溶液制剂)添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。

抑菌剂(也称防腐剂) 是一类防止或限制微生物生长与繁殖的化学药品,其主要作用是保证药品品质,防止药剂被微生物污染。所有的抑菌剂都有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。本试验自2016年6月至2017年1月采用适宜的方法对该产品进行了3种配比浓度的抑菌剂效力进行测试，筛选处方中所添加的抑菌剂是否安全有效。测试方法为《中国药典》[4]2015版1121 抑菌效力检查法，接种5种代表微生物，分别在d14、d28测试微生物存活情况，综合评判所添加抑菌剂的抑菌效力。

1 仪器与试药

1.1仪器MJ-系列真菌培养箱培养箱(上海一恒科技有限公司)；SPX-250生化培养箱(上海佳胜实验设备有限公司)； 超净台(上海锦屏仪器仪表有限公司)。

1.2培养基胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA) (生产批号140505)、胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB) (生产批号130222)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA) (生产批号140312)、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液(生产批号140424) 均购于北京陆桥技术有限责任公司。培养基适用性检查实验结果均符合中国药典2015 年版要求。

1.3菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均源自中国医学细菌保藏中心，验证试验所用的菌株均为第3代。

1.4供试品四季抗病毒合剂，陕西海天制药，生产批号20150925。

2 方法与结果

2.1菌种制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆琼脂斜面上，30～35 ℃培养18～24 h； 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖琼脂斜面，20～25 ℃培养24～48 h；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面，23～28 ℃培养5～7 d加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱后制成每1 mL含孢子数107～108cfu 的菌悬液。

2.2抑菌剂浓度筛选该中药产品成分主要为鱼腥草、桔梗、苦杏仁、菊花、桑叶、荆芥、薄荷、芦根、甘草、连翘、紫苏叶。根据《药用辅料手册》收载[5]本品成分及包装与所选抑菌剂无配伍禁忌。设定此口服液的防腐剂使用浓度分别为1#(苯甲酸钠0.3%)； 2#(苯甲酸钠0.3%+尼泊金乙酯0.04%)；3#(苯甲酸钠0.3%+尼泊金乙酯0.05%)。产品组分及防腐剂添加情况见表1。

表1 产品组分及防腐剂添加情况

2.3方法适用性试验及结果判断进行抑菌效力检查前，需对供试品的计数方法进行验证，以确定该方法在防腐剂效力检查时是否能有效检测出供试品中所有试验菌 。选取抑菌浓度最高3#进行方法适用性试验。

2.3.1供试液制备 取3#供试品10 mL，加 TSB至100 mL，制备成1∶10供试液。

2.3.2平皿计数方法 试验组 ：吸取1∶10供试液9.9 mL共5份，每份加入0.1 mL的试验菌悬液摇匀后，使加入后每1 mL供试液含菌量不大于100 cfu，分别从所有试验菌管中吸取1 mL注入直径为90 mm的平皿中，细菌平皿中加入TSA，真菌平皿中加入SDA。供试品对照组 ：吸取4份1∶10供试液1 mL注入直径为90 mm的平皿中，平行，其中两个平板中注入TSA培养基中，另两个注入SDA培养基，摇匀，测定供试品的本底菌数。菌液组：分别吸取5份9.9 mL pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。从各菌液试管中吸取1 mL注入直径为90 mm的平皿中测定。阴性对照组：以稀释液替代供试品，同供试品对照组进行试验。TSA平皿放入30～35 ℃培养3 d，SDA平皿放入20～25 ℃培养3～5 d。方法适用性结果见表2。

表2 3#样品方法适用性回收率

结果表明,3#样试验组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%，满足2015版药典要求。最终建立的方法为平皿法取1∶10的供试液，每皿1 mL进行计数，细菌计数采用TSA培养基，真菌计数采用SDA培养基。

2.4未添加抑菌剂样品抑菌效力测试考察在未添加抑菌剂的情况下四季抗病毒合剂本身对微生物抑制或杀灭能力，根据结果，评估本品中加入抑菌剂的必要性[5]。

2.4.1方法 取未添加抑菌剂的样品5瓶，分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉，使接种后供试液染菌量未105～106cfu·mL-1，充分混匀，模拟正常的使用条件20～25 ℃避光培养箱培养过程中，分别在d14、d28对供试品中存活的微生物进行计数，同时取与样品量相同的0.9%无菌氯化钠溶液5瓶，加入与上述样品组相同的试验菌液，通过梯度稀释，用平皿计数法进行计数，细菌于30～35 ℃培养3～5 d，真菌于20～25 ℃培养5～7 d后计算样品中所加试验菌菌数即初始(0时)菌液浓度。并换算成Log值见表3。

为准确计数d14、d28样品所含微生物，应按方法适用性试验进行测试，3#方法适用性也适合未添加抑菌剂的本品，最低稀释级为1∶10的供试液进一步稀释成1∶102、1∶103、1∶104等稀释级，测试结果见表3。

2.4.2结果分析 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌d14与初始值即0时比较下降的log值均<3.0；白色念珠菌、黑曲霉14 d与初始值比较下降的log值均<1.0。细菌和真菌不符合中国药典2015版抑菌剂效力检查的要求。四季抗病毒合剂本身并不具备充分的抗菌活性，为保证用药按全，应添加适宜抑菌剂。

2.5抑菌效力测定

2.5.1样品组 无菌条件下吸取的供试品20 mL至原包装瓶中，按照目标菌的个数平行制备5份，将菌悬液各吸取0.1 mL加入其中，使其最终浓度细菌为106cfu·mL-1,真菌和酵母菌为105cfu·mL-1于旋涡振荡仪上振荡均匀。加菌量不得超过容器中样品量的1%。将制备好的样品置于20～25 ℃的培养箱中储存，分别在d14和d28对供试品中存活的微生物进行计数。

2.5.2菌液组 无菌条件吸取20 mL 0.9%氯化钠溶液加入无菌玻璃瓶中，平行制备5份，将与样品组相同量的目标菌悬液加入其中，通过梯度稀释，用平皿计数法进行计数，细菌于30～35 ℃培养3～5 d，真菌于20～25℃培养5～7 d后，计算样品中所加试验菌菌数即初始菌液浓度。并换算成log值见表4。

2.5.3存活菌数测定 分别在d14、d28将样品于旋涡振荡仪上振荡均匀，无菌量取样品1 mL用TSB通过梯度稀释稀释成1∶10的供试液，进一步稀释成1∶102、1∶103、1∶104等稀释级进行测定，置规定温度规定时间培养，逐日观察结果。根据菌落测定结果，计算1 mL样品组各间隔时间的菌数，并换算成log值见表4。

分别计算1#、2#、3#样品d14、d28与初始值比较减少log值及判断标准,结果见表5。

表3 四季抗病毒合剂本身抑菌效力检查结果

表4 1#、2#、3#抑菌效力测试结果

表5 1#样、2#样、3#样品d14、d28与初始值比较减少Log值及判断标准

注：NI为未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5log

2.5.4结果分析 1#样、2#样、3#样d14存活的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌菌数与接种的细菌菌数初始值的log值相比下降均>3.0；d14存活的白色念珠菌、黑曲真菌数与接种真菌菌数初始值的log值比较下降均>1.0；d28金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌细菌菌数log值与d14细菌菌数log值比较未增加，d28白色念珠菌、黑曲真菌数的log值与d14真菌菌数log值比较未增加。由此可以看出3个样品的抑菌剂效力检查符合中国药典2015版的要求。

3 讨论

抑菌剂效力测试至关重要，抑菌剂的量添加过少，会使微生物繁殖而引起污染，抑菌剂(尼泊金乙酯)[6]的量过大，会引起许多不适或过敏等变态反应，因此，适量的添加抑菌剂显得尤为重要，按照《中国药典》2015年版四部1121(抑菌剂效力检查法)口服制剂抑菌剂效力判断标准，三个样品均能满足抑菌剂效能试验要求，但根据最小有效量添加的原则[7]，最终选择 1#样品，抑菌剂苯甲酸钠浓度0.3%，为合理添加量。

四季抗病毒合剂根据需要加入适宜的防腐剂，不得影响成品的稳定性，并避免对检验产生干扰。苯甲酸属于低级脂肪酸，在水溶液中很少电离，大部分保持分子态，对微生物的抑制主要是分子态，此种防腐剂在酸性条件下为佳。四季抗病毒合剂PH值4～6，属于偏酸环境，添加苯甲酸能更好发挥抑菌效力。