HPLC法同时*测定枳实总黄酮苷提取物中3个香豆素类成分含量

★ 王章伟 王振 邱小燕 刘芳芳 周鹏 张功俊 杨小玲 吕武清 谢宁 *（1.江西青峰药业有限公司 江西 赣州 341000；.创新天然药物与中药注射剂国家重点实验室 江西 赣州 341000）

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，具有破气消积、化痰散痞的功效，用于积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸、胃下垂、脱肛、子宫脱垂［1］等症。文献报道，枳实中主要含有黄酮类［2］、生物碱类［3］、挥发油类［4］、香豆素类［5］等成分。近年来研究发现，香豆素类化合物在啮齿类动物中存在着明显的肝脏毒性，且具有种属和位点特异性，这与其代谢途径和CYP2A6酶的多态性有关。另外，毒性作用与给药剂量和给药途径密切相关，口服和高剂量给药更容易产生毒性反应，但香豆素及其衍生物的毒性作用具有明显的阈值范围，只有在高于临床剂量时才会产生毒性作用，日常摄入量不会对人体产生不良的肝脏效应和致癌作用［6］。新药品种的潜在安全性问题，是新药审评中专家关注的重点，因此，需严格控制产品中具有潜在毒性的香豆素类成分的含量限度。

枳实总黄酮苷提取物为自主研制的中药5类新药原料药，由江西道地药材芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL枳实，经水提取、分离、纯化制成，总黄酮苷含量大于90%，用于治疗功能性消化不良［7-9］。LIU W Y 等［10］采用 LC-MS，建立了枳实醇提取物多成分同时定量测定的方法，并明确柚皮苷和新橙皮苷等可测有效成分的含量大于60%；韦锦宁等［11］采用HPLC法建立了枳实总黄酮苷提取物的特征图谱，有效控制了枳实总黄酮苷提取物中黄酮苷类成分的含量，但未对枳实总黄酮苷提取物中具有潜在毒性的香豆素类成分进行限度控制。为了全面控制原料药的质量，确保制剂产品的安全性，笔者对枳实总黄酮苷提取物进行了系统化学成分研究，除黄酮类成分外，还分离得到3个香豆素类化合物。本研究采用HPLC法同时对枳实总黄酮苷提取物中3个香豆素类活性成分：伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素、马尔敏进行含量测定，旨在完善枳实总黄酮苷提取物的质量控制体系，对保障该品种的安全性具有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪；赛多利斯CP225D型十万分之一电子天平；岛津UV-2550紫外分光光度计；美国Thermo Fisher Nicolet is5红外光谱仪；美国Agilent 1100 Series LC/MSD Trap SL；BRUKER AV-500型核磁共振谱仪。

1.2 试药 伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素、马尔敏为江西青峰药业有限公司自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS、IR等信息确证结构，经HPLC面积归一化法计算纯度依次为99.2%，98.5%，98.0%；枳实总黄酮苷提取物为江西青峰药业有限公司自制（批号：080215，090209，090212，090215，090401，110415，120810，140305，140311，140315）；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，作为单一对照品储备液；精密量取适量单一对照品储备液，加50%甲醇制成含伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷0.4μg/mL、5，7-二羟基香豆素9.0μg/mL、马尔敏0.2μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取枳实总黄酮苷提取物约500mg，精密称定，置25mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过（0.45μm），取续滤液，即得。

2.3 检测波长选择 取各对照品溶液，照紫外-可见分光光度法在190～400nm范围内扫描。

伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏的最大吸收波长均在325nm附近，因此选择325nm作为检测波长。

2.4 色谱条件 色谱柱：YMC-Pack ODS-A（4.6mm×250mm， 5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～30min，10%～13%A；30～40min，13%～35%A ；40～50min，35%～35%A ；50～51min，35%～10%A ；51～60min，10%～10%A ；检测波长：325nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；理论塔板数按5，7-二羟基香豆素峰计算应不低于3000，各化合物与相邻色谱峰分离度均大于1.5，对照品及供试品的色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）HPLC色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密称取伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品10.14mg、5，7-二羟基香豆素对照品13.02mg和马尔敏对照品15.74mg，分别置于50mL，50mL，100mL量瓶中，加甲醇溶液溶解稀释至刻度，制成单标储备液。精密量取不同体积的单标储备液，加50%甲醇溶液稀释至刻度，制成含伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷浓度依次为0.0909，0.2271，0.3634，0.4543，0.6814，1.8171，9.7344μg/mL、5，7-二羟基香豆素浓度依次为2.0832，5.2080，8.3328，10.4160，15.6240，20.8320，31.2480μg/mL和马尔敏浓度依次为0.0403，0.1007，0.1612，0.2015，0.3022，0.8059，1.2592μg/mL的混合对照品溶液。

精密吸取各浓度的混合对照品溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪，按照“2.4”项下色谱条件测定。横坐标（X）为对照品质量浓度（μg/mL），纵坐标（Y）为峰面积，绘制标准曲线，结果见表1，表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。

表1 3个香豆素类成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围

2.5.2 精密度试验 精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液20μL，按照“2.4”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰面积的RSD值（n=6）分别为0.2%，0.1%，0.3%，保留时间的RSD值（n=6）分别为0.2%，0.1%，0.1%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批号样品（批号：120810），依照“2.2”项下方法制备6份供试品溶液。精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，按“2.4”项下色谱条件，分别进样，记录色谱图。测得伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏的平均含量（n=6）分别为0.0229，0.3889，0.0042μg/mg，RSD值（n=6）分别为1.3%，1.2%，1.4%，表明该方法的重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液（批号：120810）20μL，按“2.4”项下色谱条件，分别在0，2，4，8，16，24h进样，记录色谱图。计算伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰面积的RSD值（n=6）分别为1.7%，1.3%，1.3%，表明供试品溶液在常温条件下24h内稳定性良好。

2.5.5 检测限（LOQ）和定量限（LOD） 取混合对照品溶液，用50%甲醇逐级稀释后进样测定，以信噪比约3∶1时的相应浓度计算检测限，以信噪比约10∶1时的相应浓度计算定量限。计算伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰的检测限（S/N=3）分别为0.5ng、0.3ng和0.3ng，定量限（S/N=10）分别为1.6ng、0.9ng和0.8ng。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取含量已知的枳实总黄酮苷提取物6份（批号：120810，伞形花内酯 7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→ 2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏的含量分别为0.0229，0.3889，0.0042μg/mg），每份约250mg，精密加入对照品溶液适量（含伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷 5.6784μg、5，7- 二羟基香豆素 118.08μg、马尔敏1.0106μg），依照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。计算伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰的平均加样回收率（n=6）分别为99.5%，97.9%，99.9%；RSD值分别为1.4%，1.3%，1.7%。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.5.7 枳实总黄酮苷提取物中3个香豆素类成分含量测定 各批次样品分别取2份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各20μL，按照“2.4”项下色谱条件进样测定，结果见表3。

表3 枳实总黄酮苷提取物中3种香豆素类成分含量测定/%

3 讨论与分析

3.1 色谱条件的选择 本文采用梯度洗脱法测定多批次枳实总黄酮苷提取物中3个香豆素类成分的含量，60min内完成分离，伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰的分离效果良好，符合含量测定要求。本文采用紫外-可见分光光度法进行扫描（190～400nm），3个香豆素类化合物的最大吸收波长均在325nm附近，因此选择325nm作为检测波长。流动相优选时分别考察了流动相B中的磷酸浓度和不同品牌色谱柱对检测结果的影响，结果显示流动相B中的磷酸浓度在0.05%～0.2%和使用不同品牌色谱柱时，样品中各成分色谱峰分离度好，RSD值小于2.0%，说明该方法的耐用性良好。

3.2 含量测定 由表2可知：10批次枳实总黄酮苷提取物中伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰的含量批次间存在一定的差异，含量范围分别为0.003%～0.030%，0.020%～0.049%，0.003%～0.004%，各批次样品3个香豆素化合物含量之和范围为0.038%～0.055%，均在安全剂量范围之内。因此，为确保各批次样品香豆素类化合物的含量在限度内稳定，保障临床用药的安全性，需加强工艺过程中的参数控制，确保产品质量的稳定性和重现性。

3.3 小结 采用HPLC法同时测定10批次枳实总黄酮苷提取物中伞形花内酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素和马尔敏峰的含量，方法专属性强、灵敏度高、准确可靠，有效的控制了潜在毒性成分的含量，为枳实总黄酮苷提取物质量标准制定和多指标质量控制体系的建立提供了科学依据，对保障该品种的安全性有重要的指导意义。