重组人血管内皮抑制素对大鼠脉络膜新生血管的影响

李 伟 苏锐锋 付笑笑 杨 洁 张 垒 谭小波 苏 畅(承德医学院附属医院眼科，河北 承德 067000)

脉络膜新生血管的病理特征为脉络膜的新生血管长入色素上皮下间隙或视网膜下引起渗出和出血，进一步发展形成瘢痕影响视力，甚至致盲〔1〕。脉络膜新生血管多见于黄斑部，影响视力，是致盲的主要原因之一。脉络膜新生血管在成年人中常见，特别在60岁以上老年人群中更为常见〔2〕。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是脉络膜新生血管形成的关键调节因子，抗VEGF 药物治疗在新生血管的治疗中最有潜力〔3，4〕。Endostar是新研发的重组人血管内皮抑制素注射液，具有抑制新生血管生长的作用〔5，6〕。本文探讨 Endostar对大鼠脉络膜新生血管的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 24只健康、体重(220±20)g、挪威雄性大鼠，实验前双眼均正常。Endostar(美国Gibco公司)，兔抗大鼠CD31单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美国Sigma公司)，Trizol总RNA提取试剂(美国Abcam公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 将24只大鼠随机分为对照组、模型组(脉络膜新生血管组)和Endostar组(脉络膜新生血管+Endostar)，每组8只。

1.2.2 脉络膜新生血管模型建立 将模型组和Endostar组大鼠10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉成功后，复方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，角膜麻醉采用爱尔凯因滴眼液，放置盖玻片(滴加少量氧氟沙星眼用凝胶)接触角膜，以视盘为中心，距离视盘2～3个视盘直径处，采用氪激光均匀光凝9个点，如果有气泡产生则表明Bruch膜被击穿，证明光凝成功。

1.2.3 各组大鼠处理 脉络膜新生血管形成后1 d，Endostar组大鼠玻璃体注射 5 mg/ml的 Endostar 10 μl，模型组和对照组大鼠玻璃体注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.2.4 眼底荧光造影检查 脉络膜新生血管建模后14 d进行眼底荧光造影检查。将大鼠麻醉后腹腔注射10%荧光素钠(0.5 mg/kg)，荧光造影拍照观察染料渗漏情况，评价脉络膜新生血管形成情况。脉络膜新生血管造模成功的标志为造影晚期视盘周围出现荧光素渗漏。16只大鼠均建模成功。渗漏率=渗漏点数/光凝点数。

1.2.5 脉络膜新生血管面积测定 眼底荧光造影检查结束后，麻药过量处死三组大鼠，打开腹腔、夹闭腹主动脉并剪开右心耳，左心室先灌注PBS 50 ml，再灌注异硫氰酸荧光素-右旋糖苷，摘除眼球，多聚甲醛固定，分离视网膜色素上皮层-脉络膜-巩膜并平铺于玻璃片上，显微镜观察脉络膜新生血管形态，采用Image-Pro Plus图像分析软件测量脉络膜新生血管面积。

1.2.6 脉络膜新生血管中央厚度测量 将大鼠眼杯在多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切成5 μm厚度切片，脱腊水化后进行免疫荧光染色，以CD31为一抗，阴性对照组以PBS代替一抗，荧光显微镜下观察拍照，采用Image-Pro Plus图像分析软件测量脉络膜新生血管最大中央厚度。

1.2.7 VEGF、CXC趋化因子配体(CXCL)1和缺氧诱导因子(HIF)-1α mRNA测定 提取大鼠视网膜-脉络膜-巩膜复合体DNA，采用PCR测定VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA水平，PCR反应条件:96℃ 4 min，然后94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共 42 个循环，以 GAPDH作为内参照，计算VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA的相对表达量。

1.2.8 VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白测定 提取大鼠视网膜-脉络膜-巩膜复合体总蛋白，采用免疫印迹法测定VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白水平，其相对表达量以图片的灰度值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0软件，两组计量资料采用t检验，多组计量资料采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 Endostar组和模型组脉络膜新生血管面积、渗漏率比较 Endostar组脉络膜新生血管面积、厚度、渗透率均明显低于模型组(P＜0.05)。见表1。

2.2 三组VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比较 模型组VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA均显著高于对照组(P＜0.05)，Endostar组 VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA显著低于模型组(P＜0.05)，Endostar组 VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA和对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

表1 Endostar组和模型组脉络膜新生血管面积、厚度、渗透率比较(，n=8)

表1 Endostar组和模型组脉络膜新生血管面积、厚度、渗透率比较(，n=8)

组别 脉络膜新生血管面积(pixel)脉络膜新生血管厚度(μm)脉络膜新生血管渗透率(%)Endostar组 50 324.12±2 647.57 73.24±18.69 48.79±13.24模型组 68 423.32±5 324.13 97.68±21.54 76.42±12.17 t值 10.435 3.657 3.283 P值 0.000 0.000 0.004

表2 三组VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比较(，n=8)

表2 三组VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比较(，n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05，与Endostar组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 VEGF mRNA CXCL1 mRNA HIF-1α mRNA对照组 0.10±0.01 1.25±0.26 0.13±0.04 Endostar组 0.12±0.03 1.42±0.31 0.16±0.04模型组 0.25±0.041)2) 2.78±0.451)2) 0.68±0.111)2)F值 83.217 50.326 352.574 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 三组VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白水平比较模型组VEGF、CXCL1、HIF-1α水平均显著高于对照组(P＜0.05)，Endostar组 VEGF、CXCL1、HIF-1α 水平显著低于模型组(P＜0.05)，Endostar组 VEGF、CXCL1、HIF-1α水平和对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 三组VEGF、CXCL1和HIF-1α 水平比较(，n=8)

表3 三组VEGF、CXCL1和HIF-1α 水平比较(，n=8)

组别 VEGF CXCL1 HIF-1α对照组 0.63±0.12 1.21±0.23 0.58±0.09 Endostar组 0.71±0.14 1.28±0.26 0.66±0.11模型组 1.25±0.171)2) 3.02±0.371)2) 3.12±0.231)2)F值 53.246 69.426 287.363 P值 0.000 0.000 0.000

3 讨论

新生血管性疾病的发病基础为微环境中抑制血管生成因子和促进血管生成因子比例失调。VEGF是最重要的新生血管调控因子，不仅可调控血管内皮细胞的增殖和迁移，对新生血管网络中的其他分子也具有调控作用。血小板源性生长因子、血管生成素2、碱性成纤维细胞生长因子等促进血管形成细胞因子在新生血管网络中也发挥重要作用〔7，8〕。内皮细胞抑制素对新生血管生长具有抑制作用，对VEGF等生长因子与其相应受体结合具有阻止作用;对金属蛋白酶活性具有抑制作用，对其降解细胞外基质具有阻断作用，可诱导内皮细胞停滞在G1期及凋亡等，较VEGF抗体具有更广泛的效应〔9，10〕。Endostar作为新型的重组人血管内皮细胞抑制素，耐热性和耐酸性能较高，半衰期较长，生物活性增加，溶解度升高〔11～13〕。本文结果发现，Endostar具有抑制脉络膜新生血管形成的作用。

血管生成过程包括内皮细胞和外膜细胞被激活、内皮细胞迁移、膜基质降解、内皮细胞分化、内皮细胞增生、血管成熟与稳定。VEGF通过和内皮细胞膜上的受体结合产生生物学效应，是血管生成最直接的刺激物，对血管生成的大多数环节具有调节作用，包括调节内皮细胞的增生、迁移，血管管腔的形成，内皮细胞外基质的溶解等〔14，15〕。CXCL1可由中性粒细胞、内皮细胞、巨噬细胞分泌，属于CXC家族成员之一，与其受体结合后参与血管生成反应〔16〕。HIF-1α是缺氧诱导因子，对VEGF和其他相关分子具有调节作用，从而参与血管新生过程〔17，18〕。本研究结果发现，Endostar对脉络膜新生血管的抑制作用可能与Endostar降低VEGF、CXCL1、HIF-1α 表达有关。VEGF是新生血管的直接刺激物，其水平下降，使其对血管生成的刺激降低，内皮细胞的增生、迁移及血管管腔的形成下降;CXCL1、HIF-1α水平下降使其对血管形成的调节作用下降，从而对脉络膜新生血管具有抑制作用。