白龙灵沙汤对小鼠Lewis肺癌MMP-2、TIMP-2及MVD表达的影响

胡志萍 甘 宁 陈焕朝 李泽浩 江建平 付皓云(湖北省肿瘤医院中西医结合科，湖北 武汉 430079)

肺癌的发病率与死亡率均呈上升趋势〔1〕，癌症的预防和治疗已成为临床迫切需要解决的问题之一〔2〕。手术或放化疗虽然能够控制肿瘤进展，但副作用较大，中医药在抗肿瘤研究治疗方面有显著效果，特别在抑瘤、增效减毒、预防复发和转移等方面，弥补了肺癌手术、放化疗治疗的不足〔3〕。白龙灵沙汤在临床中应用多年，是对非小细胞肺癌的治疗有效方剂，前期研究表明白龙灵沙汤可提高患者的免疫功能〔4〕，本研究采用免疫组化的方法，分析白龙灵沙汤对小鼠Lewis肺癌基质金属蛋白酶(MMP)-2、组织金属蛋白酶抑制物(TIMP)-2及微血管密度(MVD)表达的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄雄性C57BL/6小鼠50只，体重(20±2)g，由湖北省实验动物研究中心提供。所有动物均饲养于清洁级动物房，实验过程中动物自由摄食和饮水，室温20～25℃，湿度40%～70%。

1.2 药物及试剂 白龙灵沙汤药物组成(成人1日剂量):白英 30 g，龙葵 30 g，灵芝 10 g，沙参 15 g，补骨脂10 g;将中药浸泡0.5 h后煮沸煎制约0.5 h，纱布过滤后文火煎制，浓缩滤液，使含生药3.333 g/ml;兔抗-TIMP-2抗体、兔抗-bFGF抗体、兔抗-MMP-2抗体、兔抗-CD34抗体均由北京博奥森生物技术有限公司提供(货号分别为 bs-0416R、bs-0217R、bs-20706R、bs-0646R)。

1.3 仪器 正置显微镜(OLYMPUS公司)，石蜡切片机(徕卡显微系统有限公司)，摊片机(湖北康强医疗器械有限公司)，IMS图像分析系统(武汉华联科生物技术有限公司)。

1.4 分组 40只雄性C57BL/6小鼠在实验室稳定条件下饲养1 w后，随机分成模型组，白龙灵沙汤高、中、低剂量组，每组10只。

1.5 Lewis肺癌模型建立 无菌条件下操作，取传代好的带瘤小鼠的实体瘤块，用剪刀剪成小碎块，用套管针移植或用玻璃匀浆器加生理盐水(1∶1.5)磨成匀浆，计数用2.5 ml浆液中的瘤细胞，用生理盐水研磨并调整细胞数到1×107/ml，每只0.2 ml用右腋部皮下接种。

1.6 给药方法 各组于肿瘤接种后次日开始给药。白龙灵沙汤高、中、低剂量组分别按白龙灵沙汤成人日推荐剂量的20倍、10倍、5倍换算给药量，即高剂量组33.33 g·kg－1·d－1，中剂量组 16.67 g·kg－1·d－1，低剂量组8.33 g·kg－1·d－1。模型组予等体积双蒸水灌胃，1次/d，连续28 d。末次给药24 h后取材进行指标检测。

1.7 一般情况观察 观察各组小鼠精神状态、活动状况、对刺激的反应、体重下降幅度、食欲和脱毛等指标。

1.8 瘤重、抑瘤率检测 末次给药24 h后将小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离肿瘤体后称重(W)，计算抑瘤率(I):I=(模型组W－治疗组W)/模型组W×100%。

1.9 免疫组化染色法检测MMP-2和TIMP-2表达瘤体取下后经甲醛固定48 h，梯度酒精脱水、浸蜡，石蜡包埋切片4张，切片厚度4 μm。切片脱蜡、水化。水浴法进行抗原修复，pH6.0，柠檬酸缓冲液加热至95～99℃，放入切片30 min，然后室温下静置20 min，取出切片，磷酸盐缓冲液(PBS)液洗待用;显色剂显色。MMP-2和TIMP-2均以血管内皮及间质细胞中出现棕黄色颗粒为其阳性细胞。每张切片中取具有阳性颗粒数目最多的5个间质区视野(400×)，用IMS图像分析系统定量检测阳性颗粒的面积、平均光密度来表示其在瘤体中的表达量。

1.10 免疫组化染色法检测MVD表达 微血管检测用抗细胞黏附分子CD34标记血管内皮细胞，以内皮细胞胞质中出现棕黄色颗粒的微血管为阳性微血管。结果判断:在低倍视野内(100×)找到肿瘤组织内MVD最高的区域，然后在高倍视野内(400×)通过计算机图像分析系统在监视器上计数微血管的数目，凡呈现棕色单个细胞或细胞簇者均作为1个血管计数单位，管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。每张切片在400倍视野下计数5个视野，取平均值。

1.11 统计学分析 用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，方差检验齐性者用LSD法，方差不齐者用Games-Howell法检验。

2 结果

2.1 一般情况观察 各组小鼠接种前及给药前一般情况无差异，各受试小鼠自接种肿瘤后均出现不同程度的生长。模型组肿瘤体生长较快，高剂量组生长最慢。给药7 d后模型组和低剂量组逐渐出现精神萎靡，对外界刺激反应下降，活动减少，进食量有所减少，皮毛光泽度不佳。至给药28 d实验结束时，模型组小鼠活动进一步减少，对外界刺激反应迟钝，每日进食量少，喜扎堆生活，体质量下降，毛色干燥晦暗无光泽甚至干枯脱落。高剂量组小鼠活动无明显减少，对外界刺激反应较为敏感，每日进食量有一定减少但不明显，毛色相对较有光泽。中、低剂量组表现差不多。整个实验中无死亡。

2.2 各组W、I比较 给药28 d后，与模型组比较，各治疗组平均W均一定程度降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，而与白龙灵沙汤低剂量组相比，白龙灵沙汤中、高剂量组明显降低(P＜0.05，P＜0.01)。白龙灵沙汤中、高剂量组平均I高于白龙灵沙汤低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

表1 各组W、I比较(，n=10)

表1 各组W、I比较(，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.01;与白龙灵沙汤低剂量组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01;下表同

组别 W(g) I(%)模型组 8.49±1.63 －白龙灵沙汤高剂量组 3.08±0.711)3) 62.92±13.153)白龙灵沙汤中剂量组 4.03±0.861)2) 52.03±8.642)白龙灵沙汤低剂量组 5.87±1.131) 45.76±9.33

2.3 各组MMP-2表达比较 给药28 d后，与模型组比较，各治疗组MMP-2表达阳性面积、平均光密度均显著降低(P＜0.01);与白龙灵沙汤低剂量组比，中、高剂量组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 各组MMP-2、TIMP-2、MVD表达比较(，n=10)

表2 各组MMP-2、TIMP-2、MVD表达比较(，n=10)

组别 MMP-2TIMP-2阳性面积(mm2) 平均光密度/IOD 阳性面积(mm2) 平均光密度/IOD MVD(mm2)模型组 6 015.3±1031.2 0.369±0.059 1 649.3±294.5 0.195±0.038 87.16±16.19白龙灵沙汤高剂量组 3 017.2±493.61)3) 0.208±0.0311)3) 3 397.5±681.71)3) 0.307±0.0571)3) 46.16±8.681)3)白龙灵沙汤中剂量组 3 291.8±501.61)3) 0.221±0.0381)3) 3 164.2±583.41)2) 0.289±0.0421)2) 49.22±9.051)3)白龙灵沙汤低剂量组 4 371.6±783.11) 0.291±0.0451) 2 894.6±520.61) 0.271±0.0491) 53.64±10.421)

2.4 各组TIMP-2表达比较 给药28 d后，与模型组比较，各治疗组TIMP-2表达阳性面积、平均光密度显著升高(P＜0.01);与白龙灵沙汤低剂量组比，中、高剂量组均显著升高(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

2.5 各组MVD表达比较 给药28 d后，与模型组比较，各治疗组MVD均显著降低(P＜0.01);与白龙灵沙汤低剂量组比，中、高剂量组一定程度降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2 讨论

肺癌在全球总体发病率已位居各类癌症之首，在我国肺癌发病率居恶性肿瘤之首，其中男性为第一位，女性为第二位〔5〕。祖国医学对于肺癌的治疗积累了丰富的经验，在改善肺癌患者的生活质量、延长患者的生存期方面有明显优势。白龙灵沙汤方中白英味甘、苦，性寒，具有清热解毒、祛风除湿、利水消肿之功效;龙葵味苦性寒，具有清热解毒、活血消肿的功效;灵芝味甘，性平，具有补气安神、止咳平喘的功效;沙参味甘微苦，性微寒，具有养阴清肺、益胃生津的功效;补骨脂味苦，性辛温，具补肾健脾纳气的功效，诸药共奏扶正消瘤之效。

肿瘤的生长和转移是一个复杂的多步骤过程，受诸多因素影响。近年研究发现，实体癌的生长和转移需要持续的血管生成，有关肿瘤血管生成与肿瘤的生长、转移及预后等关系已引起许多学者的关注，研究发现〔6～8〕MVD 与肿瘤的转移、复发、预后等关系密切，是一个反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数。

肿瘤细胞及微环境分泌的生物因子在肿瘤的复发和转移过程中扮演重要角色。研究表明，肿瘤的复发及转移首要条件为肿瘤细胞必须具有降解细胞外基质的能力〔9，10〕。MMPs是降解细胞外基质的主要成分之一，其中 MMP-2是 MMPs家族中的关键作用因子〔11，12〕，研究表明〔13，14〕，MMP-2 和 TIMP-2 可能均参与了非小细胞肺癌新血管生成的调节。

本实验中模型组小鼠进食、活动、体质、体重、对外界刺激等一般精神状况较差，而各治疗组小鼠一般状况优于模型组，且呈剂量相关，高剂量组与给药前变化不大，与临床〔4〕相吻合。

本实验结果表明，肺癌的发生是一个极其复杂的过程，白龙灵沙汤作为复方制剂对于肺癌的作用可能是多方面的，本实验从对肺癌组织中MMP-2、TIMP-2及MVD的影响方面探讨了白龙灵沙汤的抑瘤作用，对该方的临床应用提供理论依据。