氨基羟乙酸对慢性酒精中毒大鼠海马线粒体及纤维状肌动蛋白的影响

代 玄 付鹏艳 侯佳宝 姜洪波 杜爱林 张瑞岭 罗晓秋 (新乡医学院生理学与神经生物学教研室 中英脑功能损伤联合实验室 河南省高校脑研究重点实验室培育基地，河南 新乡 453003)

慢性酒精中毒是一种潜在的可以致人死亡的疾病。过量饮酒对脑组织有一定影响，可造成大脑学习记忆、认知判断等功能下降，出现神经行为异常等问题，不仅严重损害患者的身体健康，而且可能引发一系列的社会安全问题。研究〔1～5〕显示饮用酒精可引起学习、记忆水平下降和精神行为功能缺陷。氨基羟乙酸(AOAA)是胱硫醚-β-合成酶(CBS)活性抑制剂〔6〕，可使H2S含量减少，进而抑制 Ca2+内流，减轻细胞内Ca2+超载，从而改善受损中枢神经系统的功能。细胞骨架是维持细胞正常形态与功能的重要结构，其中F-actin是细胞最重要的骨架成分之一。F-actin的完整对于维持内皮细胞的正常功能是必需的〔7〕。本实验探讨AOAA对慢性酒精中毒大鼠组织损伤和行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 60只清洁级健康雄性SD大鼠，体重120～160 g，由新乡医学院动物管理中心提供，实验前在22～25℃实验室中适应性饲养5～7 d。随机分为正常对照(NC)组、AOAA治疗(AR)组、慢性酒精中毒模型(M)组，每组20只。高速冷冻离心机由德国Heraeus公司生产;Eclipse E200显微镜由日本Nikon公司提供;NaHS由美国ACROS公司提供;超微量总ATP酶测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒、线粒体提取试剂盒由中国南京建成生物工程研究所提供;AOAA由美国ACROS公司提供;兔抗F-肌动蛋白(actin)抗体购自北京Solarbio公司;SP试剂盒由中国博奥森公司生产;二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;其他试剂均为国产或进口分析纯级。

1.2 模型建立 除NC组外，各组饮含6%(V/V)酒精水溶液28 d，酒精溶液每日9∶00配制，置换，构建慢性酒精中毒大鼠模型〔8〕。14 d后，AOAA溶解在1 ml生理盐水中，每日腹腔注射一次，连续14 d，剂量为NC组1 ml生理盐水，AR组5 mg/kg。

1.3 学习和记忆能力评价 各组进行Y型电迷宫测试〔9〕，Y型电迷宫分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个臂，随机选择作为安全区。每臂顶端设立一个信号灯，灯亮后提示此臂为安全区。学习记忆测试均在晚间暗光、安静下进行，将大鼠置于迷宫中，并打开三条臂的指示灯，让其适应环境，适应3 min后将灯熄灭。随机打开其中一臂的指示灯，指示灯不亮的两臂自动延迟5 s后通电电击大鼠，直至大鼠逃避到安全区为止，然后灯亮持续15 s后熄灭，完成1次测试。大鼠在10 s内一次直接逃至安全区为正确反应，否则为错误反应。以10次电刺激后有9次做出正确反应为学会，用大鼠做出正确反应所需训练的次数来表示其空间分辨反应的学习记忆成绩，训练次数越少，说明大鼠学习能力越强。

1.4 分光光度法间接测定海马组织H2S的含量 在波长670 nm处测定吸光度，根据H2S标准曲线计算溶液中的H2S含量，海马中H2S含量以单位重量的组织H2S的量(nmol/g)表示。

1.5 电子显微镜下观察线粒体形态结构 取海马组织制成样本，电子显微镜观察并摄片。

1.6 海马线粒体提取 按照线粒体提取试剂盒说明书，依次经过机械方法破裂细胞、低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器、高速差速离心获得线粒体。

1.7 蛋白浓度测定 按照蛋白定量测试盒说明书测出样本蛋白浓度。

1.8 线粒体ATP酶活力的测定 按照超微量总ATP酶测定试剂盒说明书，依次经过样本前处理，酶促反应和定磷反应。使用分光光度计在波长636 nm处测定吸光度，根据公式计算出ATP酶的活性。

1.9 免疫组化观察F-actin 每组随机选取4只大鼠，全部用作免疫组化检测，每只大鼠取脑、固定、包埋、切片。石蜡切片经脱蜡复水后，进行免疫组化，DAB显色，常规脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察双侧海马并摄片。

1.10 统计处理 使用SPSS13．0进行t检验。

2 结果

2.1 学习记忆成绩 与NC组相比，M组学习和记忆能力明显降低，表现为学会空间分辨所需训练次数显著增高(P＜0.01);与M组相比，AR组学会空间分辨所需训练次数明显减少(P＜0.01)。见表1。

2.2 海马组织中H2S的含量 与NC组相比，M组海马组织内H2S含量明显增高(P＜0.01);与M组相比，AR组海马组织中H2S含量显著降低(P＜0.01)。见表1。

表1 各组学习记忆能力和海马组织中H2S的含量(，n=20)

与NC组比较:1)P＜0.01;与M组比较:2)P＜0.01;下表同

组别 学会空间辨认的训练次数 H2S(nmol/g)NC 组 40.250 0±4.008 3 27.430 5±1.520 4 M 组 83.562 5±4.925 71) 44.505 6±2.401 31)AR 组 64.437 5±3.915 21)2) 36.707 5±2.123 31)2)

2.3 电镜观察海马组织中线粒体形态结构 NC组海马组织细胞内的线粒体电镜下形态完好，偶有缺损;M组大多线粒体内出现空泡，嵴断裂而且肿胀变形;AR组线粒体形态有所改善。见图1。

2.4 线粒体ATP酶活性 与NC组相比，M组海马组织内的线粒体ATP酶活性明显降低(P＜0.01);与M组相比，AR组海马组织内线粒体ATP酶活性显著上升(P＜0.01)。见表2。

2.5 光镜观察海马组织中F-actin表达 各组海马CA1区均可见一定量F-actin表达。与NC组相比，M组F-actin含量明显降低(P＜0.01);与M组相比，AR组F-actin含量显著上升(P＜0.01)。见表2和图2。

表2 各组海马组织中线粒体ATP酶活性和F-actin平均光密度值(，n=4)

表2 各组海马组织中线粒体ATP酶活性和F-actin平均光密度值(，n=4)

组别 ATP酶活性( μmolPi·mgprot－1·h－1)F-actin平均光密度值NC 组 2.096 8±0.033 9 0.056 3±0.002 6 M 组 1.485 3±0.042 91) 0.031 1±0.002 01)AR 组 1.631 2±0.053 71)2) 0.039 9±0.002 31)2)

图2 各组海马组织F-actin表达(×400)

3 讨论

慢性酒精中毒可以对中枢神经系统的正常功能造成严重损害，引起学习记忆方面的认知功能障碍。本研究提示，AOAA能减轻慢性酒精中毒大鼠所致的记忆力下降，提高学习记忆能力。

H2S 是体内重要的气体信号分子〔10～13〕。脑内含硫氨基酸(蛋氨酸)在体内代谢生成半胱氨酸，半胱氨酸在CBS催化下生成H2S〔14〕。生理浓度下，H2S可以舒张血管，抗氧化应激，维持大鼠学习记忆、智力水平。而高浓度的H2S对活体器官具有一定的伤害作用:一方面体现在对中枢神经系统的抑制作用，能够特异性地抑制兴奋性突触后膜电位，从而阻滞突触传递，抑制神经元正常的功能〔15～17〕;另一方面通过增强 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的钙超载，使线粒体肿胀变形、能量代谢出现障碍，导致细胞逐步坏死〔18，19〕。而慢性酒精中毒可以激活 CBS，催化 H2S大量形成〔19〕;AOAA 是 CBS 活性抑制剂〔6〕，可以通过抑制CBS活性来减少组织中H2S含量。

线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中产生能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺血、缺氧及一些疾病状态下，此酶活力发生改变〔20〕。

actin是真核细胞最主要的骨架成分之一，它有单体(G-actin)和纤维状(F-actin)两种形式，这两种形式之间可以相互转换〔21〕。研究证明，酒精的主要成分乙醇及其代谢产物乙醛、氧自由基及高浓度H2S的毒性效应可以使F-actin的装配能量不足和分解加剧，导致细胞内F-actin含量降低，使细胞骨架溶解、重构、塌陷，从而导致突触结构改变，突触传递受到阻滞，引发神经元功能障碍，降低其智力水平〔22〕。

综上所述，AOAA可减轻慢性酒精中毒对大鼠脑组织的损伤，可能是通过降低组织内H2S含量，从而保护线粒体的功能，减轻酒精对F-actin的损伤进而保护神经元的结构和功能，使慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力和智力水平提高。