小檗碱对代谢综合征肾损害患者肠道双歧杆菌和炎症因子的影响

王丽萍 黄春来 陈小青 张 勇 邱妙华 庄永泽

代谢综合征的发病率逐年增加，越来越多的研究表明代谢综合征是导致和加重肾脏损害的危险因素[1-2]。因此研究代谢综合征合并肾损害的病因、发病机制和防治策略非常重要。双歧杆菌是肠道内主要的益生菌，与代谢综合征、肥胖、2型糖尿病(T2DM)等代谢性疾病密切相关。众多研究提示小檗碱具有调节肠道菌群，降低血糖、血脂，改善胰岛素抵抗、代谢性内毒素血症及全身慢性低度炎症状态等多种作用[3-6]。基于此，我们猜测小檗碱可能部分通过调节肠道双歧杆菌数量发挥其对代谢综合征肾损害的治疗作用。故本文拟观察小檗碱对代谢综合征肾损害患者肠道双歧杆菌和炎症因子的影响，同时观察患者相关指标的变化，以期得出小檗碱保护代谢综合征肾损害患者的理论依据。

对象和方法

研究对象选取2016年1月至12月在福州总医院肾内科经临床诊断符合代谢综合征肾损害的患者20例，应用计算机生成随机数字表方式随机分成基础组治疗(对照组)和联合小檗碱治疗组(治疗组)，每组各10例。其中对照组男性7例、女性3例，平均年龄(35.62±1.43)岁；治疗组男性7例、女性3例，平均年龄(37.30±1.96)岁。同时选取性别、年龄相匹配的健康体检者10例作为正常组。

纳入标准(1)代谢综合征的诊断：参照中华医学会糖尿病分会(CDS) 2013标准[7]；(2)年龄18～60岁；(3)尿微量白蛋白/肌酐比值(U-mAlb/UCr)在30～200 mg/mmol；(4)血清肌酐(SCr)≤176.8 μmol/L；(5)肾损害出现在代谢综合征之后；(6)汉族，无饮酒及吸烟史，饮食习惯以谷类、蔬菜和少量肉类为主；(7)愿意在我院接受治疗和随访，并签署知情同意书。

排除标准(1)对小檗碱过敏者；(2)12个月内使用糖皮质激素者；(3)在8周内使用肾素血管紧张素系统(RAS)阻断剂者；(4)糖尿病急性并发症(包括糖尿病急性感染、糖尿病低血糖症、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高渗性昏迷及糖尿病乳酸性酸中毒)；(5)T1DM、妊娠糖尿病、特殊类型糖尿病；(6)急性肾损伤者；(7)妊娠或哺乳期妇女；(8)合并严重心、脑、肝和造血系统疾病及精神病患者;(9)肿瘤、传染病；(10)合并慢性炎症；慢性胃肠功能紊乱，近4周内腹泻或其他胃肠道疾病史；(11)采样前1月内服用抗生素、非甾体类药物、益生元、益生菌和微生态制剂(如酸奶)人群；(12)有肠道手术及其他应激情况人群；(13)存在泌尿系或其他系统感染者。

退出标准(1)治疗期发生不良事件，持续超过7天，无法继续试验：①丙氨酸转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)>正常值上限的2倍；②SCr>176.8 μmol/L；③白细胞<3.0×109/L或中性粒细胞<1.5×109/L；(2)研究者认为，严重违背方案(患者不能遵循研究流程及用药要求、用药依从性过低、擅自应用降低小檗碱疗效的含鞣质的中药)；(3)患者连续7天未按方案服用小檗碱(各种原因)；(4)治疗过程中出现病情恶化，经判断须停止临床试验者；(5)患者在研究期间不愿继续进行临床试验。(6)患者在受试过程中出现腹泻、痢疾等胃肠道疾病，或者在受试过程中使用抗生素，经判断须停止临床试验者。

观察指标和标本收集

观察所有入选者的一般资料，包括血压、身高、体重、腰围、腹围，并计算体质量指数(BMI)。常规方法检测空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPBG)、空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、U-mAlb/UCr。

访视当天留取空腹静脉血液标本5 ml，低速离心分离出患者的上层血清(常温，3 000 r/min，10 min)，放入-80℃冰箱保存。

访视前一天20:00后禁食禁水，访视当天清晨空腹留取清洁中段晨尿15 ml，低速离心分离上清液(常温，3 000 r/min，5min)，放入-80℃冰箱保存。

留取访视当天的粪便标本，用无菌4 ml Ep管收集，标本量应>2g(体积约占无菌Ep管一半以上)，并迅速置于-80℃冰箱保存。

检测方法

血清及尿液白细胞介素6(IL-6)测定 采用ELISA法进行操作，所有操作严格按照试剂盒内所附说明书进行：准备、加样、温育、配液、洗涤、加酶、显色、终止、测定。用ELISA Calc回归/拟合计算程序，测吸光度OD值，绘制标准曲线，并计算出标准曲线的方程式，由方程式计算出样品浓度。

粪便双歧杆菌拷贝测定 采用QRT-PCR法进行操作:(1)称取样品0.2g于灭菌离心管，离心除去杂质，收集菌体。再严格按照DNA提取试剂盒的操作步骤，提取粪便总的DNA，最后检测提取基因组的浓度，分装后放入-20℃保存。(2)根据双歧杆菌总菌16SrRNA基因序列，选用的引物序列为：上游引物5，-3，：GCGTGCTTAACACATGCAAGTC，下游引物5，-3，：CACCCGTTTCCAGGAGCTATT，进行PCR扩增。回收的PCR产物进行TA克隆、电泳分析、提取质粒，最后进行QRT-PCR样本检测，得出双歧杆菌的拷贝数。

统计学方法采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，计量资料组内比较采用配对t检验，组间比较采用组间方差分析，符合正态分布采用t检验，非正态分布采用秩和检验；相关性分析：符合正态分布的采用Pearson相关分析，非正态分布用Spearman相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

从上述分析可知，机械臂的承重性能与弹簧刚度、弹簧固定位置以及连杆的初始角度有关。为研究验证机械臂的静力学性能，利用ADAMS软件对机械臂进行仿真试验。将机械臂三维模型进行相应简化，导入ADAMS软件进行仿真研究。弹簧连杆机械臂仿真模型如图5所示。

结 果

两组患者基线资料治疗组和对照组患者年龄、性别分布均无统计学差异。两组干预治疗前腹围、腰围、BMI、血压、FBG、血脂、FINS、2hPBG、SCr、血清尿素氮及基础治疗情况均无统计学差异(表1)。所有患者均有超重和脂代谢紊乱，对照组6例合并糖代谢紊乱或糖尿病者，高血压6例；治疗组4例合并糖代谢紊乱或糖尿病者，高血压7例。两组基础用药情况(包括ACEI、ARB、调脂药物和二甲双胍等)无差异。

表1 各组治疗前后一般指标的比较

BMI：体质量指数；FBG：空腹血糖；2hPBG:餐后2h血糖;FINS:空腹胰岛素;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇；U-mAlb/Ucr：尿微量白蛋白/肌酐比值；T0:第0周；T1:第8周；#：与对照组T1比较，P<0.05；△：与同组T0比较，P<0.05

治疗前后一般指标的比较与治疗前比较，治疗组患者8周后BMI、收缩压、舒张压、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C、U-mALb/Ucr均明显下降(P<0.05)，对照组患者8周后收缩压、舒张压、U-mAlb/Ucr也明显下降(P<0.05)；治疗8周后，与对照组比较，治疗组BMI、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C明显下降(P<0.05)。两组治疗前后在腰围、腹围、HDL-C、TC及U-mAlb/Ucr比较上均无明显差异性(P>0.05)(表1)。观察期间两组均无严重不良事件发生。

血清及尿液IL-6浓度的变化与正常组比较，对照组与治疗组患者治疗前血清IL-6、尿IL-6均明显升高(P<0.05)；治疗8周后，治疗组患者血清IL-6、尿IL-6明显下降(P<0.05)，而对照组未见明显下降，两组间比较有统计学意义(表2)。

肠道双歧杆菌拷贝量的变化与正常组比较，对照组与治疗组患者治疗前肠道双歧杆菌均明显下降(P<0.05)；治疗8周后，治疗组患者肠道双歧杆菌明显升高(P<0.05)，而对照组未见明显升高，两组间比较有统计学意义(表3)。

表2 各组血清及尿液IL-6浓度的比较

IL-6：白细胞介素6；T0:第0周；T1:第8周；*：与正常组比较，P<0.05；#：与对照组T1比较，P<0.05；△：与T0比较，P<0.05

表3 各组肠道双歧杆菌的比较(平均拷贝数×108/g)

T0:第0周;T1:第8周；*:与正常组比较，P<0.05；#:与对照组T1比较，P<0.05；△:与T0比较，P<0.05

肠道双歧杆菌与血、尿IL-6水平的相关性采用Spearman相关性分析发现，代谢综合征肾损害患者肠道双歧杆菌与血清IL-6(r=-0.583；P=0.007)及尿IL-6(r=-0.843；P<0.001)均呈负相关关系(图1)。

图1 肠道双歧杆菌与血、尿白细胞介素6(IL-6)的相关性

讨 论

双歧杆菌是人体肠道菌群中最常见的益生菌之一，参与宿主的新陈代谢、能量吸收、免疫防御及维持健康的肠道环境等，对人体健康发挥不可替代的作用。研究显示肠道双歧杆菌数量增加，可缓解内毒素血症，改善糖代谢及慢性低度炎症状态，提示双歧杆菌能够通过调节肠道屏障来改善代谢综合征[8]，亦有学者发现增加双歧杆菌数量可缓解代谢综合征中糖脂代谢异常[9]。Philippe等[10]发现双歧杆菌可以诱导体重的减轻，影响代谢综合征的多个组分。总之，越来越多的证据表明双歧杆菌可能与慢性炎症和代谢综合征相关，其数量在一定程度上可反映机体的健康状态。

IL-6是一种糖蛋白，除可被脂肪细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等分泌外，还可被肾脏系膜细胞、肾小管上皮细胞及肾脏毛细血管内皮细胞分泌。大量研究表明IL-6与胰岛素抵抗(IR)密切相关，在IR状态下，血清IL-6升高，且与胰岛素敏感性相关[11]。已证实血清IL-6与FINS水平及T2DM的发展呈正相关[12]，而与代谢综合征的其他组分如HDL-C、BMI呈明显负相关[12-13]。

本研究结果显示，代谢综合征肾损害患者肠道双歧杆菌拷贝数明显低于正常组，血清IL-6显著高于正常组；Spearman相关性分析显示，肠道双歧杆菌与血清IL-6水平呈直线性负相关，与既往研究一致，说明代谢综合征合并肾损害患者肠道双歧杆菌与健康人肠道内双歧杆菌总菌数存在显著差异，且存在低度炎症状态，并随着双歧杆菌拷贝数量的减少，炎症状态越明显。双歧杆菌作为肠道有益菌的一大类菌，近些年来大量研究发现肥胖、T2DM、代谢综合征等代谢性疾病补充益生菌制剂后，可改善慢性低度炎症等代谢性紊乱[14]。由此，我们推测代谢综合征肾损害患者存在肠道菌群的紊乱，其特点是双歧杆菌等有益菌的减少，导致了亚临床炎症状态，进而造成肾脏损伤。但是具体通过哪条途径造成的肾脏受损，需进一步研究。

近年来，已有明确临床证据表明小檗碱能够对代谢综合征的多个组分发挥治疗作用，如降低FBG、2hPBG、FINS及TG和LDL-C水平等，并且保护代谢综合征的肾损伤[3]。李鑫等[4]用小檗碱灌胃治疗高脂高糖喂养的T2MD大鼠后，发现小檗碱通过调节肠道菌群结构，可减少脂多糖(LPS)吸收入血，降低内毒素血症。康超颖等[5]研究显示小檗碱可以调整肠道微生物，抑制条件致病菌的生长，减轻炎症因子的生成。陈玲玲等给予T2DM患者小檗碱治疗后，发现其可显著提高T2DM患者肠道双歧杆菌数量，降低血浆LPS，并可降低空腹血糖及血脂[6]。

本研究显示，代谢综合征肾损害患者经小檗碱治疗后肠道双歧杆菌明显升高，血、尿IL-6水平明显下降，而对照组治疗前后无明显差别，提示小檗碱可显著增加肠道双歧杆菌的拷贝量，与既往研究一致。因此，我们推测可能是因为其有调整肠道菌群的作用，减少了LPS入血，改善内毒素血症，缓解对具有释放促炎症因子靶器官的刺激，从而对代谢综合征肾损害发挥保护作用。

综上可知，小檗碱可提高肠道双歧杆菌数量，降低血、尿IL-6，改善患者糖脂代谢等，对临床有一定治疗作用。但因门诊及住院相关代谢综合征肾损害的病例少，故本研究仍存在一定的不足之处，包括样本量偏少，随访周期有限，肠道菌群检测指标仅限于双歧杆菌等。有待进一步增加样本例数、延长随访观察周期，增加其他肠道菌群的研究，以更全面反映肠道菌群变化。