保元排毒丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响*

王身菊，唐丽君，邵 馨，朱美凤，郑宏香，陈 岱

(南京中医药大学附属常州市中医医院，江苏 常州 213000)

慢性肾脏病(chronic kidney disease CKD)是临床常见病、多发病，其发病率和病死率逐年升高，已成为目前全球亟待解决的健康问题[1]。原发性肾小球疾病、糖尿病肾病、梗阻性肾病等各种CKD的结局都是肾纤维化，如何防治肾纤维化是大家面对的共同难题。中医中药在防治肾纤维化方面有一定的优势，本课题组采用保元排毒丸治疗CKD患者，取得了较满意的临床疗效[2-4]。本研究通过制作UUO大鼠肾脏纤维化模型，观察保元排毒丸对UUO模型大鼠肾小管上皮转分化的影响，以探讨保元排毒丸延缓肾纤维化的可能机理。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠48只，7～8 周龄，体质量(190±8) g，购自南京医科大学实验动物中心(动物生产许可证号码SCXK(苏)2016-0002)。进食标准普通饲料，自由饮水，日常光照，适应性饲养3 d后进入实验。

1.2 实验药品

保元排毒丸(药物批号160902)来源于南京中医药大学附属常州市中医医院制剂室，由生黄芪70 g、黄精35 g、冬虫夏草3. 5 g、生晒参1.75 g、生大黄21 g、丹参35 g、六月雪70 g、接骨木70 g等药物组成，水泛蜜丸，每丸重 0.14 g，相当于生药含量的0.38 g。厄贝沙坦(商品名：安博维)150 mg/片，由赛诺菲杭州制药有限公司生产。

1.3 主要试剂

苏木素-伊红染液、Masson染色试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司)，DAB 显色试剂盒(DAKO)，TRIS(Solarbio T8060)，Trizol Reagent、BCA蛋白定量检测试剂盒及SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)，兔源性E-cadherin抗体(三鹰公司，货号20874-1-AP)，鼠源性а-SMA抗体(Boster，货号BM0002)。

1.4 主要仪器

JJ-12 J型脱水机、JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，烤箱、RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)，NIKON ECLIPSE CI正置光学显微镜。752-P紫外分光光度计(上海现科仪器有限公司)，neofuge 15R冷冻离心机(heal force)，DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂)，alphaEaseFC灰度分析软件(Alpha Innotech)，Stepone plus荧光定量PCR仪(ABI)，多样品研磨珠均质仪(Omni)。

2 方法

2.1 分组及UUO大鼠模型建立

48只健康清洁级雄性SD大鼠，适应性饲养3 d后按随机数字表分为假手术组、UUO组、保元排毒丸低剂量组、保元排毒丸中剂量组、保元排毒丸高剂量组和厄贝沙坦组6组各8只。除假手术组外，其余各组均按文献方法[5]造模。以3%戊巴比妥钠，按照0.2 m L/100 g 腹腔注射麻醉，麻醉成功后固定大鼠，剃去右背部毛发暴露皮肤，聚维酮碘消毒皮肤3遍，铺无菌手术巾。在距脊柱约1～1.5 cm，肋缘下做长约 1～1.5 cm纵行切口，逐层剥离皮下筋膜，切开肌肉暴露出肾盂及输尿管，玻璃分针分离出右输尿管，近肾盂处结扎输尿管2次，从两结扎中间剪断输尿管后逐层缝合关闭腹腔，以聚维酮碘消毒皮肤切口，用无菌敷料覆盖包扎。假手术组只分离右输尿管不结扎，然后逐层缝合。

2.2 给药

将保元排毒丸溶于蒸馏水中，分别配成浓度为25%、12.5%、6.25%的溶液，放置冰箱冷藏以备用。造模第2天开始给药共灌胃14 d，保元排毒丸低、中、高剂量组分别给予保元排毒丸1.25 g·kg-1d-1、2.5 g·kg-1d-1、5.0 g·kg-1d-1，厄贝沙坦组给予厄贝沙坦12.5 mg·kg-1d-1，假手术组和UUO组给予自由进食及等容积生理盐水灌胃。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 尿蛋白、血肌酐、尿素氮测定 于末次灌胃后放入代谢笼，禁食不禁水，收集24 h尿液，纸片法测24 h尿蛋白定量；末次灌胃24 h后眼眶采血，并通过全自动生化分析仪检测血肌酐和尿素氮。

2.3.2 肾组织病理 于末次灌胃24 h后同前法麻醉后取右肾剔除包膜，用无菌纱布吸干水分，电子天平称取右侧肾脏湿重后，纵切一半右肾置于4%多聚甲醛中固定；右肾另一半分装于EPP管中于-80 ℃保存，待进一步检测。固定24 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，切4.0 μm薄片。按试剂盒方法进行HE、Masson染色，显微镜下观察肾脏病理学改变，按Banff 分级进行 0～3级半定量计分，记录连续不重叠的10个200 倍视野数值，取其平均值比较每例切片的肾小管间质区域病变程度及肾纤维化程度。

2.3.3 免疫组化测肾组织E-cadherin、а-SMA表达 将4 μm石蜡切片脱蜡至水后，沸水浴实施抗原修复15 min， PBS(PH7.4)洗涤3次，每次5 min；3%过氧化氢溶液(双氧水：纯水=1∶9)，室温避光孵育25 min，PBS洗涤3次，每次5 min； 3% BSA封闭，加相应的一抗 (E-cadherin抗体1∶200，α-SMA抗体1∶100稀释)，4 ℃湿盒内孵育过夜；PBS(PH7.4)洗涤3次，加入HRP标记的二抗完全覆盖切片组织，于37 ℃ 下孵育45 min，PBS洗涤3次，二氨基联苯胺 (DAB) 显色，苏木素淡染细胞核1 ～ 3 min，脱水透明后使用中性树胶封片；假手术组用PBS代替上述一抗。显微镜下以棕黄色颗粒为阳性，每张切片在高倍镜(200倍) 下随机选取10 个不重叠视野。使用Image Pro-Plus 6 软件测定累积光密度(integrated optical density，IOD)为统计值进行半定量分析。

2.3.4 Western Blot法测肾组织E-cadherin、а-SMA表达水平 取保存于-80 ℃的肾组织，用冷PBS洗涤2～3次，去除血污剪成小块置于匀浆器，加入适量裂解液后冰上彻底匀浆。1500 g离心10 min，收集上清即为总蛋白溶液，BCA法测蛋白浓度。每上样孔加4 μg 总蛋白行10% SDS-PAGE 胶电泳。湿转法电转移至PVDF 膜，用封闭液封闭1 ～ 2 h后，各组分别加入适当稀释后的E-cadherin(1∶2000)、а-SMA(1∶2000)抗体4 ℃ 过夜。辣根过氧化物酶(HRP) 标记的二抗用TBST稀释3000倍，室温孵育30 min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min，化学发光剂 ECL 反应5 min曝光，扫描蛋白条带，将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析所测得的各指标吸光度与内参照GAPDH吸光度的比值代表定量值。

2.4 统计学方法

3 结果

保元排毒丸高剂量组在造模过程中因麻醉而死亡1只。

3.1 尿蛋白、血肌酐、尿素氮测定

表1显示，与假手术组比较，UUO组血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量均有增高(P<0.01)；与UUO组比较，保元排毒丸各剂量组血尿素氮和尿蛋白定量均明显降低(P<0.01)，保元排毒丸低、中、高剂量组血肌酐有不同程度降低(P<0.05，P<0.01)；保元排毒丸各剂量组之间血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量无明显差异，保元排毒丸高剂量组尿蛋白低于厄贝沙坦组(P<0.05)。

表1 各组血尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白定量及肾组织E-cadherin和а-SMA比较

注：与假手术组比较：◆◆P<0.01；与UUO组比较：#P<0.05，##P<0.01；与厄贝沙坦组比较：☆P<0.05

1～6组分别表示假手术组、UUO组、厄贝沙坦组、保元排毒丸低剂量组、保元排毒丸中剂量组和保元排毒丸高剂量组。

3.2 肾组织 HE 染色和 Masson 染色

图1显示，UUO组大部分肾小管管腔扩张明显，肾小管上皮细胞部分溶解、脱落，部分肾小管萎缩或塌陷，部分可见有蛋白或细胞管型，肾间质弥漫性炎性细胞浸润。保元排毒丸低、中、高剂量组和厄贝沙坦组见肾小管上皮细胞结构较完整，间质炎细胞浸润比UUO组减少，肾小管扩张减轻(P<0.01)。厄贝沙坦组与保元排毒丸各剂量组的病理变化大致相当。

注：A.UUO组； B.假手术组； C.厄贝沙坦组；D.保元排毒丸低剂量组；E.保元排毒丸中剂量组； F.保元排毒丸高剂量组(下同)图1 各组大鼠肾组织HE 染色(×200)

图2显示，UUO组见增宽的间质有较多蓝紫色条索状胶原沉积，假手术组肾小管间质、小球基底膜及系膜区无明显胶原沉积肾；保元排毒丸各剂量组和厄贝沙坦组蓝紫色胶原沉积明显少于UUO组(P<0.01)。

图2 各组大鼠肾组织Msson染色(×200)

3.3 肾组织E-cadherin和а-SMA表达

图3表1显示，假手术组E-cadherin表达主要分布于远端小管和集合管， 主要位于肾小管上皮细胞的胞浆基底侧， UUO组E-cadherin表达明显弱，非常少量地表达于肾小管上皮细胞的胞浆中。与UUO组比较，保元排毒丸各剂量组的E-cadherin蛋白表达均明显上调(P<0.05)，保元排毒丸各剂量组和厄贝沙坦组E-cadherin蛋白表达无明显差异。

图3 各组大鼠肾组织E-cadherin表达(免疫组化)(×400)

图4 各组大鼠肾组织а-SMA表达(免疫组化)(×400)

图4表1显示，假手术组а-SMA表达以血管为主，肾间质及上皮细胞未见明显表达；UUO组а-SMA 表达明显增强(P<0.01)，以扩张的肾小管表达为强，间质亦可见到阳性表达； 保元排毒丸各剂量组的а-SMA表达以扩张的肾小管为主，间质可见少量表达，明显少于UUO组(P<0.01)。

3.4 Western Blot法测 E-cadherin、а-SMA表达

图5表1显示，与假手术比较UUO组E-cadherin表达明显减少(P<0.01)，а-SMA的表达明显增强(P<0.01)；与UUO组比较，保元排毒丸各剂量组的E-cadherin表达明显增强(P<0.01)，а-SMA的表达明显减少(P<0.01)。

图5 各组大鼠肾组织E-cadherin、а-SMA蛋白的表达(Western Blot法)注：A.UUO组； B.假手术组； C.厄贝沙坦组；D.保元排毒丸低剂量组；E.保元排毒丸中剂量组； F.保元排毒丸高剂量组

4 讨论

CKD的共同病理表现是肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)，主要表现为小管损伤坏死，胶原、纤维连接蛋白和层黏连蛋白等细胞外基质的沉积[6]。常沉积的细胞外基质以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原为主，主要由肌成纤维细胞分泌产生。研究发现，1/3以上的肾间质肌成纤维细胞起源于肾小管上皮细胞[7]。肾小管上皮细胞向间充质细胞转化，(epithelial-mesenchymal transformation，EMT) 在合成肌成纤维细胞的发生发展过程中起重要作用[8]。肾小管上皮细胞在炎症、缺血、缺氧等因素影响下，丢失上皮细胞的表型，转化为具有分泌功能的肌成纤维细胞的过程，即肾小管上皮细胞转分化(TEMT)[9]。肾小管上皮细胞转分化形成肌成纤维细胞，直接参与肾间质纤维化的进程，是肾纤维化的重要机制之一[10]。а-SMA是肌成纤维细胞合成的一种特征性蛋白，在肾间质纤维化发生发展过程中，а-SMA阳性肌成纤维细胞是导致肾间质纤维化的主要细胞[11]。а-SMA是肌成纤维细胞的特异性标志物。上皮细胞的黏附能力丧失，Ecadherin表达缺失或减弱是肾小管上皮细胞转分化的标志[12]。本实验选用E-cadherin和а-SMA作为EMT的标志。

保元排毒丸为全国名中医张志坚治疗CKD的经验方。张志坚认为，肾病的发生不外乎先天禀赋异常、后天失养或劳作过度、冒雨涉水受风而发，风邪或从上受，或由外而内蕴伏于肾，风为百病之长，易伤肺脾肾，故肺脾肾虚损常为本病的素因，而以脾肾虚损为重；脾虚生湿，湿蕴成浊、浊聚成毒，久病致瘀入络，风湿瘀交阻病情缠绵难愈。针对慢性肾衰共性核心病机“脾肾两虚、风湿瘀阻”，提出脾肾气阴两虚、风湿瘀阻证为慢性肾衰最常见证型，慢性肾衰的基本治法为益肾健脾、祛风清利、化瘀泄浊。据此病机研制保元排毒丸，主要由生黄芪、黄精、人参、冬虫夏草、丹参、接骨木、生大黄、六月雪等中药组成。方中生黄芪补肺固表、利水消肿；黄精平补肺脾肾；人参大补元气、补脾生津；冬虫夏草甘温益气、保肺补肾；紫丹参活血祛瘀；接骨木祛风利湿、活血化瘀；六月雪清热利湿；生大黄苦寒泻下、荡涤肠胃、降泄浊邪。诸药相伍，补泻兼施，清消并用，共奏益肾健脾、祛风清利、化瘀泄浊之功，治疗CKD临床疗效可靠[2-4]。

单侧输尿管梗阻大鼠模型是一种研究肾间质纤维化发生机制、肾脏细胞转分化和评价肾间质纤维化疗效的理想模型[13]。本实验UUO组肾小管、肾间质病变重，肾纤维化重，表明UUO模型成功，UUO组血肌酐、尿素氮均高于各给药组。从临床经验看，单侧输尿管梗阻不至于引起血肌酐和尿素氮的升高，因为肾脏具有强大的代偿能力，这点鼠与人的结果不太一致。也有学者[14-15]得出了同样的实验结果，单侧输尿管梗阻大鼠术后2周血肌酐升高，有可能是大鼠对急性肾损伤的代偿能力弱于人。UUO组24 h尿蛋白定量升高，保元排毒丸低、中、高剂量组和厄贝沙坦组24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮均明显低于UUO组，表明保元排毒丸有降低血肌酐、尿素氮和蛋白尿的作用。保元排毒丸高剂量组蛋白尿水平低于厄贝沙坦组，提示保元排毒丸降蛋白尿的作用可能优于厄贝沙坦组，这需要在今后的动物实验和临床中进一步观察。与UUO组比较，保元排毒丸低、中、高剂量组和厄贝沙坦组肾小管、肾间质病变明显减轻，肾纤维化减轻，提示保元排毒丸有延缓肾间质纤维化的作用。免疫组化和Western Blot均证实，UUO组E-cadherin表达减少，а-SMA表达明显增多，说明模型组大鼠肾组织发生了转分化。保元排毒丸低、中、高剂量组E-cadherin表达明显高于UUO组，а-SMA表达明显低于UUO组，表明保元排毒丸有抑制肾小管上皮转分化的作用。至于保元排毒丸通过何种途径抑制肾小管上皮转分化需要进一步探讨。

综上所述，保元排毒丸能降低UUO大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮延缓肾纤维化，其机理可能与抑制肾小管上皮转分化有关。