陈炜,梁健芬,蒋凌飞,吴林,张兴博
(1广西中医药大学第一附属医院,南宁 530023;2广西中医药大学)
帕金森病(PD)是临床常见的神经退行性疾病之一,病理基础为黑质与纹状体多巴胺能神经元进行性缺失,多巴胺合成受阻,此病发病隐匿,早期诊断相对困难,临床治疗以恢复脑内多巴胺水平、控制病情为目标[1]。研究[2,3]指出,线粒体代谢异常诱发的多巴胺能神经元自噬参与了PD的发生发展,通过外源性的三磷酸腺苷(ATP)干预激活线粒体-ATP-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径,可加剧PD大鼠神经元自噬和神经功能损伤。就传统中医学而言,PD属“震颤麻痹”范畴,病位在脑,属“本虚标实”之证,本虚指肾虚,标实为内风、瘀血、痰浊所致心神失主。加味五虎追风散出自《晋男史传恩家传方》,主要用于祛风止痉,现代药理学研究发现其在治疗PD方面也有积极作用[4,5]。文献[6,7]报道,加味五虎追风散在保护多巴胺能神经元功能方面有积极作用,但具体机制尚未明确。中药组方具有多靶点的作用优势,加味五虎追风散是否能够作用于线粒体-ATP-mTOR途径介导的多巴胺能神经元自噬尚不得知。本研究观察了加味五虎追风散对PD大鼠脑组织多巴胺能神经元自噬活性的影响,并探讨其可能机制。
1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠100只,月龄6~8个月,体质量(200±20)g,由浙江中医药大学实验动物中心提供[许可证号:SCXK(浙)2015-008]。
1.2 药物、试剂及仪器 加味五虎追风散由广西中医药大学第一附属医院中药房提供(江苏江阴天江药业有限公司),为新型浓缩颗粒剂(蝉蜕6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蚕10 g、大地棕根15 g),每袋含原生药材9 g;西罗莫司(华北制药股份有限公司,国药准字H20050812),规格:1 mg/片×10片,批号:130521200001W;戊巴比妥钠、6-羟基多巴胺、阿扑吗啡(Sigma公司)。线粒体提取试剂盒、ECL试剂盒、BCA试剂盒(上海宝生物),抗体(Abcam公司)。大鼠立体定向仪(北京友诚嘉业生物科技有限公司,51600),微量注射泵(深圳瑞沃德生物科技有限公司,KDS310),垂直电泳和电转印装置(伯乐生命医学产品(上海)有限公司,Mini-Protean),台式低速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司,TDL5M),切片机(德国莱卡,RM2126),倒置显微镜(德国奥林巴斯,IX83),透射显微镜(德国卡尔蔡司,LIBRA 200),线粒体呼吸检测仪(英国汉莎仪器有限公司,Oxytherm),生物发光检测仪(北京原平皓生物技术有限公司,TD20/20n)。
1.3 实验动物分组、PD模型制备及加味五虎追风散给予方法 100只大鼠随机分为中药组、西药组、模型组、对照组各25只。各组大鼠均脑内埋管,即以1%的戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉,麻醉完全后固定于立体定向仪,常规皮肤脱毛和消毒后进行开颅手术。采用医用电钻钻开颅骨,将套管埋入大鼠脑内,以螺丝固定不锈钢套管,位置调整得当后以牙科胶将套管和螺丝一起固定于颅骨。埋管后大鼠自由生存10 d,期间每天肌肉注射青霉素预防感染。埋管的第11 d,模型组、中药组和西药组通过微量注射泵予以6-羟基多巴胺溶液[将10 μg的6-羟基多巴胺溶于4 μL生理盐水中(含0.2%维生素C)]制备PD模型,对照组仅予以4 μL生理盐水(含0.2%维生素C),流速均为0.5 μL/min。注射6-羟基多巴胺后休养1 d,第2 d进行模型评价[行为学评价:皮下注射阿扑吗啡0.05 mg/kg,诱导健侧旋转行为,记录旋转圈数,持续30 min,平均转数>7 r/min者定义为模型制备成功;脑组织病理评价方法:各组随机取6只大鼠,取中脑组织制备病理切片,免疫组织化学实验测定黑质DA能神经元标志物内酪氨酸羟化酶(TH)和α-突触核蛋白(α-syn)表达,以TH表达下调、α-syn表达上调为模型制备成功标准;剔除模型不成功者和死亡者]。制模成功后次日,中药组大鼠灌胃加味五虎追风散(无菌蒸馏水溶解),给药量为1.2 g/kg,1次/d,连续1周;西药组灌胃西罗莫司(研为末,溶解于无菌蒸馏水),给药量为0.27 mg/kg,1次/d,连续1周;对照组和模型组均灌胃等体积无菌蒸馏水。
1.4 大鼠脑组织多巴胺能神经元自噬活性指标Beclin 1、LC3B检测 各组随机取大鼠(中药组7只、西药组8只、模型组9只、对照组13只),断头取取脑,分离出中脑和纹状体,采用总蛋白质抽提试剂盒提取蛋白质,采用免疫蛋白印记实验检测Beclin 1、LC3B蛋白。主要步骤:①组装电泳槽,配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶和电泳液,凝胶固定后进行上样,控制每个上样通道的样品蛋白含量为10 μg,先40 V预电泳30 min清除胶内杂质,再90 V电泳1 h,此时不同分子量的蛋白依次分开并排列于胶体中;②组装电转印的“三明治”结构进行转印,将SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白转印至硝酸纤维素膜,以便抗体孵育;③4%脱脂牛奶封闭60 min,3%的脱脂牛奶配置抗体稀释液,PBST液清洗后一抗孵育,Beclin 1、LC3B、β-actin抗体浓度分别为1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500,4 ℃过夜;PBST液清洗后二抗孵育,二抗浓度均为1∶2 000,37 ℃、90 min;④ECL试剂盒荧光显色,显色良好者暗室显影,并保留胶片,采用影像学分析软件Image J分析灰度值。
1.5 大鼠脑组织线粒体活性、ATP合成酶活力、p-mTOR检测 各组随机取6只大鼠(用于线粒体活性、ATP合成酶活力检测),断头取脑,分离出中脑和纹状体,电动匀浆,用线粒体提取试剂盒提取线粒体。①线粒体活性:采用线粒体呼吸检测仪检测state3的呼吸速率、state4的呼吸速率,并计算线粒体呼吸控制比(RCR),RCR=state3的呼吸速率/state4的呼吸速率,以此评价线粒体活性。②ATP合成酶活力:采用生物发光检测仪检测线粒体ATP合成酶活力,检测方法为荧光素-荧光素酶发光法。
配置5 mL反应体系(0.5 mmol EDTA、10 mmol 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、5 mmol磷酸盐缓冲液、2.5 mmol MgCl2、0.5 mol苹果酸、0.25 mol谷氨酸、100 μL荧光素-荧光素酶、50 μg线粒体),所有试剂现用现配,并以该体系的发光强度作为底物强度。ADP启动反应,记录发光强度在不加线粒体和ADP的平行实验中,加入1 nmol ATP,记录发光强度,标定ATP合成量。③p-mTOR:所取大鼠及p-mTOR检测步骤均与“1.4”相同,其中p-mTOR抗体浓度为1∶2 000。
2.1 各组脑组织Beclin 1、LC3B蛋白表达比较 结果见表1。
表1 各组脑组织Beclin 1、LC3B蛋白表达比较
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与西药组比较,△P<0.05。
2.2 各组脑组织线粒体活性、ATP合成酶活力、p-mTOR表达比较 结果见表2。
表2 各组脑组织线粒体活性、ATP合成酶活力、p-mTOR比较
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。
PD是临床常见的神经退行性疾病之一,发病率随年龄的增长而递增,主要表现为静止性震颤、运动迟缓和肌肉强直等运动缺陷,部分患者伴有认知功能损害和神经精神功能异常。PD的病理基础为黑质与纹状体多巴胺能神经元进行性缺失,多巴胺合成受阻,据悉只有多巴胺能神经元缺失达到50%以上时才会表现出明显的临床症状,因此PD发病隐匿,早期诊断相对困难。目前,临床上应对PD的主要策略仍是对症支持治疗,以恢复脑内多巴胺的水平、控制病情为目标。左旋多巴仍是治疗PD的最有效药物,其起效快、疗效确切,但也存在较大不良反应,可影响患者的精神状态,且长期应用药效减弱。西罗莫司是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,目前临床多用于预防器官排斥和免疫调节,随着mTOR在神经性疾病中,如癫痫、PD、神经紊乱等介导的重要机制被逐渐揭示,西罗莫司在诸多疾病的基础研究中取得了进展[8]。动物研究[9]已证实,西罗莫司PD大鼠的多巴胺能神经元具有保护作用。研究者相继开发了多巴胺受体激动剂(溴隐亭、吡贝地尔、普拉克索)、多巴胺释放剂(金刚烷胺)和单胺氧化酶B抑制剂(司来吉兰)等,均有其应用瓶颈,或单独使用效果差,需佐助左旋多巴,或不良反应大,或适用人群有限[10]。因此,毒副作用小、适用人群广的新的抗PD药物仍需要继续摸索。
五虎追风散出自《晋男史传恩家传方》,主要用于祛风止痉,现代药理学研究发现其在治疗PD方面也有积极作用[11,12]。原方五虎追风散由蝉蜕、天南星、天麻、全蝎、僵蚕、朱砂组成,具有祛瘀化痰、熄风止痉的功效,主治破伤风、中风恢复期等神经系统病变。既往临床研究已证实,五虎追风散在PD、神经痛、各种中风后遗症及小儿痉症中均取得了良好的应用效果。也有研究指出,五虎追风散能够缓解左旋多巴诱发的异动症,佐助左旋多巴用药可降低药物不良反应发生率。我们认为五虎追风散虽重治其标,但对其发病之本不能兼顾,所以在五虎追风散的基础上去有毒性的朱砂而加入壮药大地棕根成为加味五虎追风散。方中蝉蜕既能祛外风,又能熄内风,而解痉止颤;天南星苦温辛烈,善能开泄以祛风解痉,为专治经络风痰的要药;全蝎、天麻、僵蚕活血化瘀、平熄内风而止颤;壮药大地棕根补肾祛风行血,全方配伍精炼全面,标本兼治,共奏补肾活血、化痰通络熄风之效。
在自噬相关分子中,Beclin 1是形成自噬体的必需分子,也是自噬体成熟的重要标志物[13]。LC3B有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ两种形式,静息状态下以LC3Ⅰ的形式存在,当自噬启动后,LC3Ⅰ在自噬相关蛋白ATG7、ATG12等的作用下与磷脂酰乙醇胺共价结合,形成LC3Ⅱ,并结合在自噬体膜上,因此LC3ⅡI/LC3Ⅰ可以作为衡量自噬活性的指标[14]。本研究显示,与对照组比较,模型组Beclin 1、LC3B蛋白表达升高,说明PD大鼠启动了细胞自噬作用来缓解黑质神经元和线粒体损伤;与模型组比较,中药组和西药组均能够提高细胞自噬活性,协助机体发挥神经元保护作用;另外本研究还发现,加味五虎追风散对自噬的调控强度不如西罗莫司,但对癫痫病理和线粒体活性的改善效果却与西罗莫司相仿,说明加味五虎追风散还能够通过自噬以外的机制来发挥神经元保护作用。
既往有研究证实,线粒体损伤是PD的重要原因,脑组织约占全身体重的2%,耗氧量却占人体的20%左右。线粒体是细胞能量代谢和活性氧产生的中心,负责机体细胞和组织的ATP供应。PD患者黑质和杏仁核区域存在大量水肿和坏死的线粒体,这些线粒体的堆积导致能量代谢异常和活性氧供应障碍,从而促进了多巴胺能神经元的损伤与死亡。及时清除缺损线粒体是保护黑质多巴胺能神经元和抑制PD病情发展的一条重要途径,而细胞自噬是真核细胞降解自身老化、受损细胞器,并将其用于重新供能的关键生物学行为。mTOR是自噬的一个抑制因子,西罗莫司相当于自噬启动剂。在缺血缺氧状态下,mTOR对ATP极为敏感,一旦ATP水平出现较大幅度的下降,mTOR便会受到抑制,引起自噬增强,以满足机体在应激状态下的能量和活性氧供应。本研究显示,与对照组比较,模型组RCR和ATP酶合成能力均降低;与模型组比较,加味五虎追风散和西罗莫司的干预均能够改善线粒体功能和ATP合成酶活力。
总之,加味五虎追风散能够通过线粒体-ATP-mTOR途径促进多巴胺能神经元自噬,发挥神经保护作用,同时也发现加味五虎追风散还能够通过自噬以外的途径来发挥神经元保护作用,其药理机制还具有较大的挖掘空间。