胃腺癌组织中TM4SF5 mRNA、蛋白的表达变化及其意义

刘斌，韩倩倩，贾永旭，秦艳茹

(郑州大学第一附属医院，郑州 450052)

胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，中国是胃癌的高发国家，据中国肿瘤登记中心最新数据估计，2015年胃癌新发病例约67.9万例，死亡病例约49.8万例，存在发病率高、预后差、生存率低等特点，严重危害我国居民健康[1]。目前，尚缺乏可靠的早期检测指标和个体化的治疗手段，研究发生发展的机制及寻找抑制发生发展传导通路中新的潜在靶点是胃癌治疗的关键。TM4SF5是含有4个跨膜结构域的L6超家族成员之一，由2个胞外环和1个胞内环以及N-末端和C-末端组成，因分子结构类似于四次跨膜蛋白超家族(TM4SF)，后被归属于TM4SF家族[2～4]。TM4SF5含有4个跨膜结构域，可与多种蛋白形成复合物，促进细胞增殖[5]，促进肝癌上皮细胞向间质细胞转化，即上皮细胞-间充质转化(EMT)，调节细胞迁移和细胞间的信号转导，在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要作用[5～9]。文献[7,10～14]报道，TM4SF5在食管癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌组织中高度表达，且与患者不良预后相关，但目前国内尚缺乏TM4SF4在胃腺癌组织中表达水平及临床意义的相关报道。本研究分别采用qRT-PCR法和免疫组化法检测胃腺癌组织中TM4SF5 mRNA、蛋白表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1～12月郑州大学第一附属医院收治的胃腺癌患者76例，男53例，女23例；年龄35～80岁，中位年龄51岁。所有患者术前均未行任何放化疗，且均经病理证实。手术留取胃腺癌组织及癌旁正常组织各76例份。患者均知情并签署知情同意书，且本研究符合伦理要求。

1.2 TM4SF5 mRNA检测方法 采用qRT-PCR法。按照TRIzol试剂按说明书中步骤提取组织标本的总RNA，用分光光度计检测A260、A280处的吸光值和RNA含量，按逆转录试剂盒说明书步骤配制RT-PCR反应体系并进行逆转录，得到cDNA用双蒸水稀释。TM4SF5 mRNA上游引物为5′-CGCTTACTTGCGAAATGACA-3′，下游引物为5′-TTTCCTGCAATCGCCACACA-3′；GAPDH上游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，下游引物为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′。以cDNA行qRT-PCR反应，扩增反应条件为：①95 ℃预变性2 min，循环1次，主要破坏DNA复杂的二级结构，利于引物和模板的结合；②95 ℃变性15 s，使双链DNA解离为单链→60 ℃退火30 s，使得引物与单链DNA配对结合→72 ℃延伸30 s，合成DNA模板互补链；循环35次；③72 ℃终延伸10 min，使得PCR反应完全，以提高扩增产量。采用2-ΔΔCt法计算TM4SF5 mRNA的相对表达量，每一个样本均独立重复实验3次。

1.3 TM4SF5蛋白检测方法 采用免疫组化法。将标本蜡块切成3 μm的切片，作免疫组化法染色，光学显微镜下(400倍)观察免疫组化检测结果。所有免疫组化结果分别由2位病理医师在未知患者临床资料、TNM分期、肿瘤级别的情况下阅片，结合阴性对照和阳性对照，判断癌组织和正常组织中TM4SF5的表达定位和表达情况。染色强度：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕色或棕褐色计3分。阳性染色细胞数量百分比：≤5%计0分，5%<～≤25%计1分，25%<～≤50%计2分，>50%计3分。将染色强度与其对应阳性细胞百分比相乘作为该样本的染色分数，运用ROC曲线确定一个最佳临界值，染色分数高于该临界值，记录为阳性表达。

2 结果

2.1 胃腺癌组织和正常组织中TM4SF5 mRNA、蛋白表达比较 胃腺癌组织、正常组织中TM4SF5 mRNA相对表达量分别为1.236±0.731、0.402±0.210，两者比较，P均<0.05。胃腺癌、正常组织中TM4SF5蛋白阳性率分别为59.2%(45/76)、13.2%(10/76)，两者比较，P均<0.05。

2.2 TM4SF5蛋白表达与胃腺癌临床病理参数的关系 结果见表1。由表1可知，TM4SF5蛋白表达与胃腺癌淋巴结转移、浸润深度相关(P均<0.05)。

表1 TM4SF5蛋白表达与胃腺癌临床病理参数的关系

3 讨论

胃癌是世界第四大常见癌症，是继肺癌之后的第二大癌症死亡原因，发病率和致死率居于消化系统肿瘤的首位[15]。根据中国胃癌流行病学登记调查，2012年全国范围内约有42.2万患者为胃癌新发，死亡病例约为29.8万例，仅次于肺癌，其发病人数占全球胃癌发病人数的42.6%，死亡人数占45%。胃腺癌是胃恶性肿瘤最常见的一种，其发生率占胃恶性肿瘤的95%，早期诊断率低，进展期胃腺癌放、化疗效果不佳，对患者的预后效果判定差。

TM4SF5是跨膜4L6家族成员，含有4个跨膜结构域，因其结构与TM4SF类似，后被纳入TM4SF家族[16]。TM4SF5可以在细胞表面形成富含tetraspanin的微区(TERMs)，TERM包含由四跨膜蛋白，生长因子受体和整联蛋白组成的蛋白质-蛋白质复合物，这些复合物可以调节细胞内外之间的信号传导，影响EMT，增强细胞的迁移和侵袭，调节控制不同的细胞功能[17,18]。有研究[19]表明，TM4SF5在肝细胞癌中呈现高表达，其与CD44相互作用可改变细胞骨架，细胞狭长如梭形，细胞间的联系消失，从而促进细胞的侵袭和转移。TM4SF5/CD44可通过酪氨酸激酶Src、信号传导及转录激活因子、转录因子Twist和Bmi1通路，即通过TM4SF5/CD44/c-Src/STAT3/Twist1/Bmi1等途径调节肝癌细胞的自我更新，如球形生长和细胞分化，从而促进肿瘤的起始和血行循环转移[5]。因此，靶向治疗信号通路中的任一环节都可能抑制癌细胞的自我更新和血行转移。此外，TM4SF5多克隆抗体在肝癌细胞的体内和体外实验中发现，该抗体抑制癌细胞的侵袭和转移，提示TM4SF5有望成为肿瘤治疗的潜在靶点[20]。

本研究显示，胃腺癌组织中TM4SF5 mRNA、蛋白表达水平均高于正常组织，提示胃腺癌组织中TM4SF5 mRNA、蛋白表达上调，TM4SF5表达异常可能与胃腺癌的发病有关。本研究还显示，TM4SF5蛋白表达与胃腺癌患者的性别、年龄、肿瘤最大直径无关，而与浸润深度、淋巴结转移相关，说明TM4SF5具有促进胃腺癌细胞的侵袭、转移能力，可能导致患者预后变差，由此猜测TM4SF5可能参与了胃腺癌细胞的转移过程。TM4SF5的过度表达导致CD63内化至晚期溶酶体膜，并且可能通过从细胞表面除去CD63来阻止CD63对迁移的抑制作用。TM4SF5和FAK之间的相互作用可以介导FAK激活，这种TM4SF5介导的激活过程似乎涉及细胞粘附后FAK中的构象释放，转导细胞内FAK，c-Src和STAT3途径的信号以调节细胞迁移和可能的ECM的产生，从而促进癌细胞的转移过程[8]。

总之，胃腺癌组织TM4SF5 mRNA、蛋白表达升高，并且TM4SF5蛋白表达还与胃腺癌浸润深度、淋巴结转移相关。本研究结果为进一步探索胃腺癌发病机制、寻找胃腺癌早期诊断标志物、开辟新的靶向治疗途径、改善患者生存与预后有着重要意义。鉴于目前TM4SF5基因在肿瘤中的功能机制研究较少，接下来希望通过扩大体外与体内实验，进一步探讨TM4SF5在胃腺癌细胞中的功能与机制，为以后科学研究提供更多理论依据。