一株高效解钾脱硅真菌的筛选、鉴定及培养条件优化①

张红芳，何 刚，吴绿英，孙德四，陈 晔



一株高效解钾脱硅真菌的筛选、鉴定及培养条件优化①

张红芳，何 刚，吴绿英，孙德四，陈 晔*

(九江学院药学与生命科学学院，江西九江 332000)

为挖掘植物内生真菌功能活性菌株资源，从钾矿区优势蕨类植物——乌蕨()中筛选得到一株高效解钾脱硅菌株WJ007。通过形态学特征观察、rDNA ITS序列分析以及系统发育关系比较等研究，确定该菌株为小刺青霉。通过单因素试验与正交试验对WJ007菌株解钾、脱硅培养条件进行优化，结果显示：WJ007菌株脱硅最优培养条件为葡萄糖作碳源、酵母膏作氮源、碳氮比60∶1、初始pH 6，在该条件下培养液中可溶性硅含量为8.74 mg/L；WJ007菌株解钾最优培养条件为葡萄糖作碳源、蛋白胨作氮源、碳氮比60∶1、初始pH 7，在该条件下培养液中可溶性钾含量为154.44 mg/L。通过对WJ007菌株解钾脱硅发酵条件的优化，可为植物内生真菌资源开发利用提供依据。

内生真菌；解钾；脱硅；筛选；鉴定；培养条件

含钾矿物中的钾、硅元素是植物生长发育过程中不可或缺的大量营养元素，在植物生理代谢过程中起着非常重要的作用。我国能被植物直接吸收利用的可溶性钾资源十分匮乏，但含钾岩石以及土壤中的含钾矿物颗粒十分丰富，这些含钾矿物绝大多数是以难溶性含钾硅铝酸盐存在，不能被植物直接吸收利用，如何从这些富含钾、硅的难溶性硅酸盐矿物中溶出可溶性的钾、硅元素供植物吸收利用，是永恒的科学问题[1-2]。目前针对不溶性钾矿资源制取钾肥的方法大体分为高温法和湿法，这些方法存在耗能大、严重污染环境等问题，而利用微生物法制取钾肥，生产成本低，无污染，耗能低，有利于实现大规模的工业化生产[3]。

国内外学者在高效解钾脱硅菌株筛选、活力测定、作用机制和优良菌株的选育等方面进行了广泛研究，但这些钾细菌在浸取钾矿过程中仍然存在菌株不稳定、解钾脱硅效应不理想等问题[4-7]，因此筛选出具有解钾脱硅作用高效稳定的优质菌株及进行条件优化仍是该领域的研究热点问题。

植物内生真菌作为一类特殊的微生物资源，与宿主植物形成互惠共生关系，可从植物中获得足够的碳源、氮源，且受到植物组织的良好保护，在帮助植物分解土壤矿物、摄取营养、抗病及促进植物生长等方面发挥重要作用[8-10]。国内外学者既开展了从土壤、植物根际、钾矿区等生境中的解钾菌株分离纯化的研究，也开展了有关解钾效应、解钾机理等方面的研究，已取得了丰硕成果，但有关从植物体内筛选解钾真菌的研究至今鲜见报道。因此，本试验以分离自钾矿区优势蕨类植物——乌蕨()内生真菌的菌株为研究对象，通过平板活性测定试验分离筛选出高效解钾脱硅活性菌株，并对其进行鉴定，同时进行培养条件优化，这不仅可增加解钾脱硅菌株资源，而且可为进一步研究植物-微生物共生体在植物矿质营养与逆境生理中的作用机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株为从龙南钾矿区(114°23′ ~ 114°59′ E，24°29′ ~ 25°1′ N)优势植物——乌蕨组织中分离得到的内生真菌，共89株，由九江学院真菌研究室提供。

1.1.2 供试矿样 钾长石样品，由九江学院鄱阳湖生态经济研究中心矿物研究室提供。矿样主要化学组成质量分数为K2O 11.09%，Al2O319.25%，SiO266.57%。矿样粉碎至100目备用。

1.1.3 供试培养基 固体或液体PDA培养基、解钾脱硅培养基[11-12]。

1.2 方法

1.2.1 解钾脱硅内生真菌菌株筛选及测定 1) 菌株初筛。将乌蕨内生真菌菌株在PDA 培养基平板上进行活化培养，活化后的菌株挑取菌块(=0.5 cm)接种至解钾脱硅固体培养基上，28℃培养 4 ~ 5 d，观察菌落形态大小、生长速度，进行解钾脱硅菌株初步筛选。

2) 菌株复筛。将初选得到的菌株(=0.5 cm)接种至 50 ml/150 ml 解钾脱硅液体培养基中，置于恒温摇床28℃、150 r/min 发酵培养 15 d，以灭活菌株作对照，每菌株 3 个重复[13]。发酵液采用过氧化氢灰化法[14]处理，取发酵处理液，用Optima 8000 型电感耦合等离子体发射光谱仪(Perkin-Elmer公司)分别测定可溶性钾和硅的含量[15-16]，然后计算出可溶性钾(或硅)的净增加量(mg/L)：=(1－0)，式中：为可溶性钾(或硅)净增加量(mg/L)；1为接菌样品中可溶性钾(或硅)含量(mg/L)；0为接灭活菌样品中可溶性钾(或硅)含量(mg/L)。

3) 菌株生物量测定。按“菌株复筛”中的方法进行液体培养，于0、1、3、6、9、12、15 d对培养液过滤得到的菌体进行干燥，称重测定菌株生物量(mg/L)，同时以灭活菌株作对照，每菌株3个重复。

4) 菌株对钾长石矿粉的作用。用体视显微镜、扫描电镜SEM(TESCAN 公司生产，型号为VEGIILSU)、能谱仪(EDS)与X射线衍射仪XRD(日本Rigaku生产，D/Max−2500型)观察真菌菌株侵蚀前后矿样的表面微观形态及矿物结构变化[16]。

1.2.2 高效解钾、脱硅菌株鉴定 1) 形态学鉴定。依据相关文献[17-18]，根据菌落形态、产孢方式、孢子形态特征和产孢结构对菌株进行形态学鉴定。

2) 分子生物学鉴定。①基因组DNA提取：参考Barnett和Hunter[19]及Guo等人[20]的方法，利用反复冻融、SDS-CTAB法提取基因组DNA。②内生真菌DNA 的PCR 扩增[21]：利用真菌通用引物Primer 1 (ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′正向)和Primer 4(ITS4：5′-TCCTCCGCTTATRGATATGC-3′反向)对内生真菌 DNA 的 ITS1、ITS2 和5.8S rRNA 区间进行扩增。扩增体系(50 μl)：Primer 1和Primer 4各0.75 μl，DNA Buffer 2.5 μl，dNTPS各2 μl，Taq E 0.4 μl，DNA模板1 μl (视情况进行不同梯度稀释，以便达到最好的效果)，ddH2O 17.6 μl。PCR反应程序：94℃预变性 2 min，94℃变性 1 min，55℃引物退火 45 s，72℃延伸 45 s，循环30次，72℃终末延伸10 min。PCR 产物采用纯化试剂盒(QiaQuick PCR purification Kit；Qiagen)进行纯化，琼脂糖凝胶电泳进行检测(上海生物工程有限公司测序完成)。③系统进化树构建：将测序结果提交NCBI数据库比对分析，选取相似性较高的典型菌株的序列，利用MEGA5.0软件构建N-J系统进化树，其BootsVap(Bootstrap)值设为1 000次重复。

1.2.3 菌株WJ007培养条件的优化 选用解钾脱硅培养基作为基础培养基，用葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖分别代替培养基中的碳源；用酵母膏、硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨分别代替培养基中的氮源；用5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1为不同碳氮比；以3、4、5、6、7、8为不同初始pH进行单因素优化试验[21]。置恒温摇床28℃、150 r/min 发酵培养15 d，每个处理设3个重复。在以上试验的基础上，按正交试验L9(34) 4因素3水平对菌株摇瓶培养条件进行优化，每组设3个重复。

1.3 数据分析

采用Origin7.5软件、MEGA5.0软件进行数据统计分析。

2 结果与讨论

2.1 解钾脱硅内生真菌菌株筛选

根据在解钾脱硅培养基平板上菌落形态大、生长速度快的特点，从乌蕨89株内生真菌菌株中初步筛选出8株具有解钾、脱硅能力的菌株(菌株编号分别为WJ005、 WJ006、 WJ007、 WJ010 、WJ012、 WJ064、WJ067、WJ074)。对初筛的8株真菌进行解钾、脱硅试验，测定其解钾、脱硅效应。结果显示：接种8株内生真菌的发酵培养液中可溶性钾净增加量在32.4 ~ 64.23 mg/L，可溶性硅的净增加量在0.364 ~1.86 mg/L，其中接种WJ007菌株的可溶性钾、硅净增加量最高，分别为64.23、1.86 mg/L(图1A、B)。因此选择WJ007菌株作为研究对象，进行后续研究。

2.2 菌株生物量的测定

初筛的8株菌株在解钾脱硅液体培养基中的生物量变化情况如图2所示。从图2中可以看出，在培养初期8株菌株在解钾脱硅液体培养基中菌丝的生长非常接近，随着培养时间的延长，菌丝生物量迅速上升，培养12 d后，生物量的增加幅度较小。与对照相比，显示8株菌株均能在含钾长石培养基中生长，其中，菌株WJ007生长速度最快，生物量最高。

图1 不同菌株对钾长石作用能力的筛选(A：解钾能力；B：脱硅能力)

图2 不同菌株在含钾长石培养基中的菌株生物量变化曲线

2.3 WJ007菌株对钾矿粉的作用

液体培养15 d后，通过体视显微镜观察(图3)，菌株WJ007作用钾长石前，菌丝球表面内壁均呈乳白色，而作用钾长石后菌丝球中包裹许多深褐色的矿粉颗粒，表现出对钾长石具有较好的亲和性。扫描电镜观察显示(图4)，菌株WJ007作用钾长石前钾长石矿样的棱角清晰，表面圆滑，晶体结构完整；作用钾长石后WJ007菌株菌丝能有效吸附和缠绕钾长石矿粉颗粒，形成矿物–真菌聚合体，钾长石表层被深度侵蚀，且其晶体结构基本被破坏。对WJ007菌株作用后的钾长石表面进行EDS能谱分析(图5)，从图5中可以看出，钾长石表面K+和Si4+含量明显高于菌株WJ007作用钾长石前，进一步说明矿物晶体结构基本被破坏后，K+和Si4+等阳离子被释放出来。这是因为矿物与菌丝形成的菌丝球微环境为菌丝及其代谢产物分化钾矿物提供了更为便利的空间，微环境中的大量代谢产物通过质子交换与络合作用将矿物表面和晶体中的K+和Si4+等阳离子释放出来[17,22]。

(A：WJ007菌株作用钾长石前；B：WJ007菌株作用钾长石后)

2.4 高效解钾脱硅菌株鉴定

根据WJ007菌株的培养性状和形态特征，参照孔华忠[23]的描述，可初步确定该菌株属于青霉属类曲霉亚属的小刺青霉Thom(图6)。

用真菌通用引物ITS1/ITS4对WJ007菌株 rDNA的ITS区进行PCR扩增，所获PCR产物经测序得到590 bp的碱基序列。通过GenBank(NCBI) Megablast搜索核酸数据库(blastn)进行比对和同源性分析。WJ007菌株ITS序列的比对结果显示该序列与小刺青霉的ITS序列同源性为100%，结合形态学特征，支持WJ007菌株为小刺青霉。为了更为直观地显示WJ007菌株与青霉属类曲霉亚属其他种的亲缘关系，采用最大似然法将本研究测定所得的序列与来自GenBank的部分青霉属类曲霉亚属序列进行分析并构建系统发育树(图7)。系统发育关系表明，WJ007菌株同来自GenBank的小刺青霉(序列登录号：KM189781、KM189526、KM189448和AF034461)聚为一支，得到了99% 靴带值的支持，进一步证实了菌株WJ007为小刺青霉。

(A：WJ007菌株作用前的钾长石；B、C：WJ007菌株孢子吸附在钾长石上；D、E：WJ007菌株菌丝吸附在钾长石上；F、G：发酵培养第9 天WJ007菌株对钾长石的作用；H：发酵培养第12 天WJ007菌株对钾长石的作用；I、J：发酵培养第15 天后WJ007菌株对钾长石的作用；K：WJ007菌株作用后的矿样；L：发酵培养第15 天接种灭活菌株矿样)

(A：WJ007菌株作用前钾长石；B：WJ007菌株作用后钾长石)

(A：菌落；B：扫描电镜下的产孢结构；C：扫描电镜下的孢子)

(本试验所获菌株序列以粗体标识，靴带值≥50% 的数值标注于分支上)

2.5 WJ007菌株解钾脱硅培养条件的优化

2.5.1 单因素试验 选择碳源、氮源、碳氮比、初始pH 4个因素，每个因素设定合适的水平数，对菌株WJ007进行培养条件单因素优化，所得结果见图8。由图8可知，菌株WJ007最优的解钾单因素培养条件为：果糖为碳源，硝酸铵为氮源，碳氮比为60∶1，pH为6；最优的脱硅单因素培养条件为：葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，碳氮比为60∶1，pH为6。

图8 不同培养条件对WJ007菌株解钾、脱硅作用的影响

2.5.2 正交试验 在单因素基础上，选择合适的因素和水平(表1)，按L9(34)正交试验对WJ007菌株解钾、脱硅培养条件进行优化，每组设置3个重复。由极差分析可知，各因素对WJ007菌株解钾影响的主次顺序为：碳源>初始pH>碳氮比>氮源，从TK1、TK2、TK3值可知，A2B3C2D3组合(碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，碳氮比为60∶1及初始pH为7)为WJ007菌株解钾能力的最优培养条件，发酵液中可溶性钾含量最高，为154.44 mg/L；各因素对WJ007菌株脱硅影响的主次顺序为：碳氮比>碳源>初始pH>氮源，从TSi1、TSi2、TSi3值可知，A2B1C2D2组合，即：碳源为葡萄糖，氮源为酵母膏，碳氮比为60∶1及初始pH为6，为WJ007菌株脱硅能力的最优培养条件(表2)，发酵液中可溶性硅含量最高，为9.74 mg/L。正交试验结果与单因素试验结果存在差异(表3)，说明培养条件各因素之间存在交互作用，正交试验结果更具说服力。

表1 正交试验水平与因素表(L34)

Table 1 Level and factor of orthogonal test(L34)

表2 WJ007菌株解钾、脱硅正交试验结果

续表

试验号ABCD硅含量(mg/L)钾含量(mg/L) 623128.3785.10 731327.5450.63 832137.6469.45 933217.3060.50 TSi1(TK1)19.67(197.53)22.91(204.43)22.72(208.35)19.98(194.25)T=65.18T=643.16 TSi2(TK2)23.00(265.05)20.64(217.03)22.99(228.13)22.94(203.36) TSi3(TK3)22.48(180.58)21.60(221.70)19.44(206.68)22.23(245.55) tSi1(tK1)6.56(65.84)7.64(68.14)7.57(69.45)6.66(64.75) tSi2(tK2)7.67(88.35)6.88(72.34)7.66(76.04)7.65(67.79) tSi3(tK3)7.49(60.19)7.2(73.90)6.48(68.89)7.41(81.85) R3.33(84.47)2.27(17.27)3.55(21.45)2.96(51.30) 主次顺序Si：C>A>D>BK：A>D>C>B 优化组合Si：A2B1C2D2K：A2B3C2D3

注：A、B、C、D分别代表碳源、氮源、碳氮比、pH；T1、T2、T3及T分别代表1、2、3水平的和及总和；t1、t2、t3及R分别代表1、2、3水平的和的均值及极差。

表3 方差分析

注：括号外数据为WJ007菌株解钾的方差分析；括号内数据为WJ007菌株脱硅的方差分析。

2.5.3 验证实验 根据正交试验优化结果，对WJ007菌株脱硅最佳培养组合，即A2B1C2D2，进行3组验证实验，结果显示，发酵液中硅的含量分别为8.37、8.74、9.11 mg/L，平均含量为8.74 mg/L；对WJ007菌株解钾最佳培养组合，即A2B3C2D3，进行3组验证实验，结果显示：发酵液中钾的含量分别为154.56、152.49、151.28 mg/L，平均含量为154.44 mg/L。结果表明，在上述培养条件下，WJ007菌株脱硅、解钾活性相对稳定，从而达到优化的目的。

3 结论

本研究利用从龙南钾矿区乌蕨中分离培养获得的内生真菌进行解钾脱硅的菌株筛选，共筛选出8株具有解钾脱硅功能的菌株，其中，WJ007为一株高效解钾脱硅的菌株。通过对其形态特征以及rDNA-ITS序列的测定和分析，鉴定其为青霉属的小刺青霉，结合单因素和正交试验得出WJ007菌株最佳发酵条件组合：碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨、碳氮比为60∶1、初始pH为7的培养条件下，发酵液中可溶性钾含量最高，为154.44 mg/L；碳源为葡萄糖、氮源为酵母膏、碳氮比为60∶1、初始pH为6的培养条件下，发酵液中可溶性硅含量最高，为8.74 mg/L。通过对WJ007菌株培养条件优化的研究，进一步说明植物内生真菌具有很广泛的开发应用前景。

[1] 徐晓燕, 马毅杰. 土壤矿物钾的释放及其在植物营养中的意义[J]. 土壤通报, 2001, 32(4): 172–178

[2] 潘大伟, 梁成华, 杜立宇. 土壤含钾矿物的释钾研究进展[J]. 土壤通报, 2005, 36(2): 253–258

[3] 易浪波, 彭清忠, 何齐庄, 等. 高效钾长石分解菌株的筛选、鉴定及解钾活性研究[J]. 中国微生态学杂志, 2012, 24(9): 773–776, 785

[4] 盛下放, 黄为一, 殷永娴. 硅酸盐菌剂的应用效果及其解钾作用的初步研究[J]. 南京农业大学学报, 2000, 23(1): 43–46

[5] 胡敏, 任涛, 廖世鹏, 等. 不同含钾物料对土壤钾素含量动态变化影响[J]. 土壤, 2016, 48(1): 48–52

[6] Badr M A, Shafei A M, Sharaf El-Deen S H. The dissolution of K and P-bearing minerals by silicate dissolving bacteria and their effect on sorghum growth[J]. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 2006, 2(1): 5–11

[7] 李佳, 张爱民, 王伟, 等. 几株硅酸盐细菌菌株的分离及解钾、解硅活性[J]. 湖北农业科学, 2013, 52(21): 5147–5152

[8] 姜道宏. 植物内生真菌及其展望[J]. 中国生物防治学报, 2015, 31 (5): 742–749

[9] 钱旭, 甘会云, 杜勇涛, 等. 龙南钾矿区常见蕨类植物可培养内生真菌的多样性[J]. 广西植物, 2016, 36(3): 342–348

[10] Lugo M A, Reinhart K O, Menoyo E, et al. Plant functional traits and phylogenetic relatedness explain variation in associations with root fungal endophytes in an extreme arid environment [J]. Mycorrhiza, 2015, 25(2): 85–95

[11] 詹寿发, 樊有赋, 甘金莲, 等. 1株山药内生真菌的鉴定及解钾活性[J]. 江苏农业科学, 2013, 41(10): 320–323

[12] 李振东, 陈秀蓉, 杨成德, 等. 乳白香青内生解磷菌的筛选鉴定及解磷特性研究[J]. 草业学报, 2013, 22(6): 158–158

[13] 谢庆东, 何琳燕, 王琪, 等. 一株高效溶解钾长石芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研究[J]. 土壤, 2017, 49(2): 302–307

[14] 张洋洋, 鲁剑巍, 王筝, 等. 不同提取方法测定的土壤钾的有效性比较研究[J]. 土壤学报, 2014, 51(3): 600–608

[15] 李新新, 高新新, 陈星, 等 . 一株高效解钾菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化[J]. 土壤学报, 2014, 51(2): 381–388

[16] 赖阳巍. 电感耦合等离子体质谱法测定土壤中的总碘[J]. 土壤, 2018, 50(1): 73–78

[17] 孙德四, 尹健美, 陈晔, 等. 钾矿物晶体结构对黑曲霉生长代谢及钾与硅的溶出影响[J]. 中国农业科学, 2014, 47(3): 503–513

[18] Keith S, Gareth M J, Walter G, et al. The genera of hyphomycetes[M]. Utrecht, The Netherlands: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, 2011: 1–997

[19] Barnett H L, Hunter B B. Illustrated genera of imperfect fungi (4 Ed.)[M]. St Paul, Minnesota: APS Press, 1998: 1–218

[20] GUO Ling-dong, Hyde K D, Liew E C Y．Deteetion and identification of endophyte fungi with in frond tissues ofbased on rDNA sequence[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2001, 20: 1–13

[21] 李敏, 厚华艳. 米曲霉()液体培养条件优化[J]. 中国调味品, 2011, 36(4): 48–50

[22] 詹寿发, 卢丹妮, 毛花英, 等. 2株溶磷、解钾与产IAA的内生真菌菌株的筛选、鉴定及促生作用研究[J]. 中国土壤与肥料, 2017(3): 142–151

[23] 孔华忠. 中国真菌志(第35卷): 青霉属[M]. 北京: 科学出版社, 2007

Screening, Identification and Cultivated Condition Optimization of High Efficiency Potassium Solubilization and Desilication Fungus Strain

ZHANG Hongfang, HE Gang, WU Lvying, SUN Desi, CHEN Ye*

(School of Pharmacy and Life Sciences, Jiujiang University, Jiujiang, Jiangxi 332000, China)

In order to excavate the functional endophyte fungi resources, a fungus strain, named WJ007 with high-efficiency potassium solubilization and desilication was screened from, it was identified asbased on morphological characteristics, rDNA ITS sequence and phylogenetic relationships analyses. Its optimal culture conditions obtained by single factor and orthogonal experimens for desiliconization were glucose as carbon source, yeast extract as nitrogen source, carbon and nitrogen ratio of 60∶1, initial pH 6, and culture soluble silicon content in liquid is 8.74 mg/L under these conditions; while its optimal culture conditions for potassium solubilization were glucose as carbon source, protein peptone as nitrogen source, carbon and nitrogen ratio of 60∶1, initial pH 7, and soluble potassium contents in culture solution is 154.44 mg/L under these conditions. It is significant for the development and utilization of plant endophytic fungi to optimize fermentation conditions of potassium solubilization and desiliconization for WJ007.

Endophytic fungi; Potassium-solubilization; Desilication; Isolation; Identification; Fermentation condition

国家自然科学基金项目(31360064；51264014)和江西省自然科学基金项目(20171BAB204007)资助。

(chenyejjtc@126.com)

张红芳(1971—)，女，江西九江人，硕士，讲师，主要从事真菌资源开发利用研究。E-mail：939044612@qq.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.05.012

S154. 39

A