Rho相关信号通路对类风湿关节炎患者FLS活性的影响

邹晋梅

(绵阳市中心医院，四川 绵阳 621000)

类风湿关节炎患者关节成纤维样滑膜细胞(FLS)不仅参与滑膜炎症，还具有肿瘤细胞样特征，较正常滑膜细胞更具迁移和侵袭力，在类风湿关节炎关节滑膜增生和组织破坏中发挥关键作用〔1〕。Rho激酶(ROCK)是RhoA下游的重要信号蛋白，RhoA/ROCK信号通路具有多种生物学功能，其中包括多肿瘤细胞活性的调控〔2〕。动物实验发现，RhoA、ROCK在类风湿关节炎模型大鼠的滑膜中表达水平均明显提升，并参与滑膜炎症反应〔3〕，但未阐明该信号通路是否调控FLS的迁移、侵袭、增殖。本研究旨在探讨RhoA/ROCK信号通路对类风湿关节炎FLS活性的调控作用。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2017年1～6月绵阳市中心医院收治的类风湿关节炎患者10例为类风湿关节炎组；另取同期行骨关节炎患者为骨关节炎组和4例无关节炎病史外伤者为对照组。入选患者均行关节镜或关节置换手术，本实验经医院伦理委员会审批，签署知情同意书。

1.2滑膜细胞分离与培养 术中取患者滑膜组织，无菌条件下移至培养皿中，剪碎后与Ⅰ型胶原酶混合，放入细胞培养箱中常规条件下孵育5～8 h。过10 μm孔径筛网，滤液转至10 ml离心管中，3 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养24 h，取培养瓶壁上黏附的FLS。形态学和免疫组化检测FLS标志物(CD55、CD106)，鉴定出FLS，继续培养3～5代用于实验。根据实验需要，分别用RhoA抑制剂(C3转化酶)和ROCK抑制剂(Y-27632)处理类风湿关节炎患者FLS。

1.3FLS总蛋白中RhoA、ROCK活性标志物表达检测 蛋白质提取试剂盒提取FLS总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定浓度。Western印迹检测RhoA活性标志物(GTP-RhoA)和ROCK活性标志物(磷酸化MYPT1)表达水平。取100 μg总蛋白行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，滴加兔抗人RhoA多克隆抗体(1∶300)、兔抗人MYPT1多克隆抗体(1∶500)、兔抗人磷酸化MYPT1多克隆抗体(1∶1 000)，选用兔源性β-actin多克隆抗体(1∶2 000)为内参，4℃孵育过夜；洗膜后滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室温下反应1 h。电化学发光法(ECL)显色，读取目标条带灰度值。

1.4FLS迁移、侵袭、增殖能力检测 采用趋化性迁移实验测定FLS迁移能力，密度为6×105的FLS接种到200 μl无血清DEME培养基中，种植到Transwell小室滤网，37℃培养1 h；将含10%FBS DEME培养基加入下室，相同条件培养12 h。按实验需求，分别用终浓度为10 mg/L的C3转化酶、10 μmol/L的Y-27632预处理2 h；计数迁移到下室的细胞数量。侵袭能力检测：先用MATRIGEL基质包被Transwell小室，之后实验操作同上。增殖能力检测：分别用不同浓度的C3转化酶、Y-27632预处理2 h，之后用10 μg/L的白细胞介素(IL)-1α刺激48 h，MTT法测定FLS增殖能力。

1.5FLS骨架蛋白F-actin表达检测 用10 mg/L的C3转化酶、10 μmol/L的Y-27632预处理类风湿关节炎患者FLS 2 h，之后用IL-1α刺激12 h。行细胞免疫荧光检测，将FLS种植于细胞爬片，培养至细胞密度为75%～80%时弃去培养液，甲醛固定细胞，-20℃静置5 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h，分为3组，均滴加IL-1α一抗(1∶50)，另外两组分别滴加C3转化酶一抗(1∶100)、Y-27632一抗(1∶100)，4℃过夜，滴加荧光Ⅱ抗，室温下避光静置1 h，细胞核DAPI染色5 min，共聚焦显微镜下观察。

1.6统计学分析 应用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组FLS总蛋白中RhoA、ROCK活性标志物表达情况 类风湿关节炎组FLS中GTP-RhoA、总RhoA蛋白相对表达量〔(7.61±1.38)、(5.08±0.75)〕明显高于骨关节炎组〔(3.17±0.52)、(2.38±0.23)〕和对照组〔(3.03±0.39)、(2.15±0.17)〕，差异有统计学意义(P<0.05)。类风湿关节炎组磷酸化MYPT1、MYPT1蛋白相对表达量〔(12.95±3.58)、(8.13±1.06)〕明显高于骨关节炎组〔(6.37±0.82)、(5.08±0.47)〕和对照组〔(4.51±0.67)、(5.39±0.53)〕，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

1 类风湿关节炎组；2 骨关节炎组；3 对照组图1 3组FLS总蛋白中RhoA、ROCK活性标志物检测

2.2RhoA、ROCK抑制剂对类风湿关节炎FLS迁移、侵袭能力的影响 单纯FBS组、FBS+C3转化酶组、FBS+Y-27632组迁移细胞数分别为(81.00±12.00)个、(49.00±14.00)个、(36.00±8.00)个；侵袭实验显示，MATRIGEL基质细胞数分别为(58.00±9.00)个、(40.00±9.00)个、(24.00±7.00)个。FBS+C3转化酶组、FBS+Y-27632组迁移细胞数及MATRIGEL基质细胞数均明显少于单纯FBS组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3RhoA、ROCK抑制剂对类风湿关节炎FLS增殖的影响 单纯IL-1α组吸光度为(1.36±0.28)；不同浓度的C3转化酶(10、20、40、60、80 mg/L)吸光度分别为(1.15±0.31)、(0.76±0.42)、(0.65±0.38)、(0.51±0.31)、(0.47±0.15)；不同浓度Y-27632(10、20、40、60、80 mg/L)吸光度分别为(1.20±0.28)、(1.03±0.20)、(0.82±0.25)、(0.57±0.16)、(0.49±0.11)。与单纯IL-1α组相比，当C3转化酶浓度20 mg/L、Y-27632浓度40 mg/L以上时，对类风湿关节炎FLS的增殖抑制作用差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4类风湿关节炎FLS骨架蛋白F-actin表达情况检测 红色为骨架蛋白F-actin，蓝色为细胞核(DAPI)，C3转化酶和Y-27632可显著抑制类风湿关节炎FLS的F-actin聚合。见图2。

图2 RhoA、ROCK抑制剂对FLS骨架蛋白F-actin表达的影响(免疫荧光，×100)

3 讨 论

类风湿关节炎的病理特征包括炎性细胞浸润、滑膜组织增生、骨质破坏等；滑膜细胞异常增殖、活化，表现出侵袭性是类风湿关节炎进展的关键环节〔4〕。活化的滑膜细胞在无炎性因子等外来刺激时仍能够保证增殖和侵袭性〔5〕。滑膜细胞持续增殖可导致类风湿关节炎滑膜组织增生变厚，并向关节腔转移、侵袭，破坏关节软骨及周围组织〔6〕。本研究表明，类风湿关节炎滑膜细胞的生物行为已出现异常改变，与正常滑膜细胞存在差异。临床研究显示，部分患者即使炎症得到控制，但关节软骨及周围组织的破坏仍在继续〔7〕，该作用机制目前尚未明确。动物实验显示，通过抑制小鼠FLS的迁移、侵袭，可有效控制类风湿关节炎病情发展〔8〕，但调控机制仍未明确。

细胞的迁移、侵袭是一个复杂的生理过程，受多种因素调控。RhoA蛋白为具有多种生物学活性的GTP酶，ROCK是其下游一个关键的信号调控蛋白，在RhoA活化信息传导方面具有重要作用。ROCK被RhoA激活后，将MLC酶磷酸化，引发细胞骨架聚合，增强细胞收缩，促进细胞前移。RhoA、ROCK信号通路在肿瘤细胞转移、侵袭方面具有明显调控作用，Rho蛋白也可能参与类风湿关节炎的发病机制〔9〕。本研究提示RhoA/ROCK信号通路可能参与调控类风湿关节炎FLS的迁移、侵袭。FLS异常增殖也是类风湿关节炎关节破坏的因素之一，本研究中RhoA、ROCK特异性抑制剂呈剂量依赖性低抑制FLS增殖。细胞骨架聚合是细胞迁移、侵袭、增殖的关键因素，本研究提示RhoA/ROCK信号通路通过影响细胞骨架聚合来调控FLS的迁移、侵袭、增殖。