维生素E对大鼠心肌缺血—再灌注损伤的影响及机制探讨

陈玲玲　方侃　李龙倜

[摘要] 目的 探討维生素E（Vit E）对大鼠心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）的影响及机制。 方法 选取雄性健康Wistar大鼠60只，按照随机数字表法将其分为Vit E组、模型组和对照组，各20只。前两组在平左心耳下缘2 mm处结扎左冠脉前降支（LAD），30 min后松解结扣再灌注，复制MIRI模型；对照组只用丝线穿过LAD但不结扎。Vit E组在造模成功即刻肌注Vit E注射液4.5 mg/（kg·d），模型组、对照组术后肌注生理盐水4.5 mg/（kg·d），连续给药2周。检测并比较不同干预对各组抗氧化指标、缺血梗死程度及血流动力学指标的影响。 结果 ①与模型组比较，Vit E组左心室收缩末期压力（LVESP）明显升高，而左心室舒张末期压力（LVEDP）、血浆心钠素（ANP）明显降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）；②与模型组比较，Vit E组血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）活性/含量明显升高，而丙二醛（MDA）含量明显降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）；③与模型组比较，Vit E组梗死区（IA）面积、缺血危险区（IDA）面积、IA/IDA、IDA/LV均明显降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。 结论 Vit E通过抗氧化应激、清除氧自由基作用改善大鼠MIRI，增强心脏功能。

[关键词] 心肌缺血-再灌注损伤；氧化应激；维生素E；血流动力学

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（b）-0012-04

Discussion on the influence and mechanism of vitamin E for myocardial ischemia-reperfusion injury of rats

CHEN Lingling1* FANG Kan1* LI Longti2 WANG Ping1 PENG Guihai1 WANG Chongquan1

1.Department of Cardiology， Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.Nursing Department， Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Objective To discuss the influence and mechanism of vitamin E （Vit E） for myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） of rats. Methods Sixty male health Wistar rats were selected and divided to Vit E group， model group and control group by random number table method， with 20 rats in each group. For the first two groups， the left anterior descending （LAD） in 2 mm near inferior margin of left auricle was ligatured， the knot was released after 30 min and taken reperfusion， then MIRI model was duplicated. For the control group， the silk yarn just was threaded through LAD rather than taken reperfusion. For Vit E group， 4.5 mg/（kg·d） of Vit E injection was injected intramuscularly as soon as the molding was done； for the model group and control group， 4.5 mg/（kg·d） of normal saline was injected intramuscularly after the operation， and the administration was conducted successively for 2 weeks. The influences of different intervention on the antioxidant index， degree of ischemic infarction and hemodynamic index in each group were tested and compared. Results ①Compared with model group， the left ventricular end systolic pressure （LVESP） in Vit E group was significantly increased， while the left ventricular end-diastolic pressure （LVEDP）， atrial natriuretic peptide （ANP） were significantly decreased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）； ②compared with the model group， the contents of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， nitric oxide （NO） activity in Vit E group were significantly increased， while the contents of malondialdehyde （MDA） were significantly decreased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）； ③compared with model group， the area of infarction area （IA） and ischemia risk area （IDA）， IA/IDA， IDA/LV in Vit E group were significantly decreased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Vit E can improve the MIRI of rats and enhance the cardiac function through antioxidant stress， oxygen free radical removal effects.

[Key words] Myocardial ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Vitamin E； Hemodynamics

冠心病（CHD）是冠脉粥样硬化后高度狭窄导致相应心肌急性缺血、坏死而引起的一系列综合征，其病死率、致残率较高。心血管介入治疗、冠脉旁路移植及药物溶栓等，是被广泛运用的再灌注方法，也是安全、有效的治疗CHD的手段。但是，这些措施在治疗的同时存在进一步损伤心肌的危险[1-4]，即心肌缺血-再灌注损伤（MIRI），其机制尚不完全明了。氧化应激被认为是MIRI导致心肌细胞死亡和功能不可逆丧失的主要机制之一[5-6]。国内外研究均证实，维生素E（Vit E）有较强的抗氧化能力，对心脏疾病有综合作用[7-9]。本研究通过冠脉前降支结扎术复制MIRI大鼠模型，采用Vit E注射液进行干预性治疗，观察大鼠血流动力学、血清抗氧化指标、血浆心钠素（ANP）浓度、心肌缺血梗死程度等变化，探讨Vit E抗大鼠MIRI的作用机制，从而有助于为心肌缺血性疾病提供新的治疗靶点和防治方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

小动物呼吸机（Kent scientific，TOPO）；小动物心电图检测仪（Softron，SP2006）；体式显微镜（Olympus SZX16）；BL-420E生物功能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。Vit E注射液（上海通用药业股份有限公司，1 mL∶5 mg，批号：E00161103）；超氧化物歧化酶（SOD，批号：20160723）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：20160622）、丙二醛（MDA，批号：20160826）、一氧化氮（NO，批号：20160902）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；人ANP检测试剂盒（Abbott Laboratories，批号：10266FL00）；伊文思蓝（Sigma）；1%氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma）。

1.2 实验动物

健康Wistar大鼠60只，雄性，SPF级，6～7周，体重（200±20）g，购于湖北医药学院实验动物中心，质量合格证号：NO.42000900000119；造模前大鼠适应性喂养2周，自由饮食，每天光照12 h，室温20～24℃；剔除逃避反应明显迟缓者。

1.3 复制MIRI模型与分组

用2%的戊巴比妥钠、按120 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定于手术台，接小动物呼吸机和心电图机，在胸骨左缘第4～5肋间隙开胸暴露心脏，在体视显微镜下辨认左冠脉前降支（LAD）。参照线圈提拉法[3]，用带6-0线的缝合针，在平左心耳下缘2 mm处，经LAD深面穿过心肌表层、套绕LAD，且在结扎线下垫入两个线圈。结扎LAD后，可见左心室前壁下部心肌变白，局部收缩，运动受限，左心耳怒张，心电图显示ST段呈弓背向上抬高，即心肌缺血制作成功。随后将两个线圈的线头分别置于切口两侧并留在体外，逐层关闭胸腔。缺血30 min后，拉出线圈、拉开结扎线，此时心电图ST段抬高部分回落，判断再灌注成功。待大鼠苏醒后，拔管，置于38℃保温毯上过夜。MIRI大鼠模型制作成功后，采用随机数字表法，将其分为两组：Vit E组，模型组。各20只。另取20只大鼠麻醉、开胸后，丝线只穿过冠脉，但不结扎，确定为对照组。

1.4 给药

Vit E组造模成功即刻，从大腿后部肌注Vit E注射液4.5 mg/（kg·d）（按成人肌注50 mg/d计算，大鼠每天等效剂量=50 mg/70 kg×6.3=4.5 mg/kg，按照1.0 mL/kg配制液体），连续给药2周；模型组、对照组术后肌注生理盐水4.5 mg/（kg·d），连续给药2周。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 血流动力学测试 于造模前及给药2周时，麻醉动物后，在心电监护下分离左颈总动脉，将连接有压力换能器、肝素化的PE导管插入左颈总动脉至左心室，分别检测并记录左心室收缩末期压力（LVESP）、左心室舒张末期压力（LVEDP）。

1.5.2 生化检测 血流动力学测试完毕，取大鼠动脉血6 mL，按3000 r/min（离心半径13.5 cm）、4℃离心10 min，分离出血浆，分装入不同EP管，置-20℃冰箱保存、待测。①遵循试剂盒说明书操作步骤、检测血清SOD、GSH-Px、MDA、NO含量；②采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测大鼠血浆ANP浓度，所有操作均按照人ANP检测试剂盒说明书进行操作。

1.5.3 伊文思蓝-TTC染色 于取血毕，再次打开胸腔，结扎冠脉，在心尖注射1%伊文思蓝0.5 mL，此时非缺血区心肌被染成蓝色，其余心肌即为缺血危险区（IDA）。立即摘取心脏、冲洗残血，切除结扎线以上心肌，置-20℃冰冻30～40 min，取出后沿左心室（LV）长轴的垂直方向切片，厚1 mm，8～10片，浸泡于1% TTC溶液中37℃孵育10 min；此時梗死区（IA）心肌呈灰白色，缺血区心肌被染色红色。在扫描心肌切片后，采用Image Pro Plus 6.0软件分别计算LV面积（全部心肌）、IDA面积（红色+白色）和IA面积（白色）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，三组间比较运用方差分析，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同干预对MIRI大鼠血清抗氧化指标的影响

对照组给药2周时4项抗氧化指标（SOD、GSH-Px、NO、MDA）与造模前比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）；而模型组、Vit E组各项指标组内差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。给药2周时，与对照组比较，模型组大鼠SOD、GSH-Px活性和NO含量明显降低，MDA含量升高；与模型组比较，Vit E组大鼠SOD、GSH-Px活性和NO含量明显升高，MDA含量降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表1。

2.2 不同干預对MIRI大鼠心肌梗死区、缺血区程度的影响

两组LV面积比较差异无统计学意义（P > 0.05）。给药2周时，与模型组比较，Vit E组IA面积、IDA面积、IA/IDA、IDA/LV均明显降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表2。

2.3 不同干预对MIRI大鼠血流动力学及血浆ANP含量的影响

给药2周时，与对照组比较，模型组LVESP明显降低，而LVEDP、血浆ANP明显升高；与模型组比较，Vit E组LVESP明显升高，而LVEDP、血浆ANP明显降低；差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表3。

3 讨论

人体细胞在正常代谢过程中，不断地产生自由基，同时也不断地清除自由基，二者处于动态平衡之中。在心肌缺血-再灌注状态下，氧自由基（ROS）产生过多，可攻击核酸、蛋白质、糖类和脂质等体内的生命大分子，使这些物质发生过氧化变性、交联和断裂，且损伤生物膜，引起细胞结构与功能的破坏，甚至细胞死亡[10-12]。研究表明，心肌缺血-再灌注时，可产生四大病理生理过程，即自由基剧增、细胞内钙超载、白细胞激活以及微循环障碍，且均与自由基的产生和作用密切相关[13-17]。

本研究结果显示，给药2周时，Vit E组血清SOD、GSH-Px、NO活性/含量比模型组明显升高，而MDA含量明显降低。这可能是维生素E强力清除自由基的结果。研究证明，一分子的Vit E提供的电子能与两分子自由基上未配对的电子结合，从而清除自由基，阻断自由基过氧化的连锁反应[14-15]。自由基清除后，对生命大分子物质攻击减少，SOD、GSH-Px活性因而升高；Vit E亦可通过促进基因表达，提升SOD、GSH-Px活性。NO含量升高，与内皮细胞的NO合酶活性增加有关；NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，NO水平增加，表明血管内皮功能和微循环功能改善[16]。脂类过氧化中断，其标志物MDA产生减少、含量降低。而SOD、GSH-Px活性提高又可以加强对自由基的清除，形成良性循环。

本研究结果进一步显示，给药2周时，Vit E组缺血、梗死程度比模型组明显降低。这是因为，应用外源性Vit E后，中断了自由基氧化应激的恶性循环，恢复了自由基代谢的动态平衡，从而阻断自由基对心肌的再损伤；同时血管内皮功能增强，微循环有效灌注增多，由此，心肌缺血梗死状态逐渐改善[13-14]。

本研究结果还显示，模型组血浆ANP浓度升高，与之相对应的心肌舒缩功能降低，左心室ESP下降和EDP升高。血浆ANP水平升高是左心室功能障碍的标志[12-18]。使用Vit E后，血浆ANP水平降低，心肌舒缩功能增强，同时左心室ESP升高和EDP下降。说明Vit E在平衡自由基代谢、降低心肌缺血梗死状态的基础上可以进一步改善左心室功能[6，19]。

总之，Vit E可能通过对抗氧化应激、清除氧自由基，而阻止心肌缺血-再灌注损伤，从而增强心肌功能。然而，其抗炎机制、抗细胞凋亡机制也可能参与其中[20-24]，互相协助，共同促进Vit E效果的表达。但Vit E准确而肯定的调控心肌缺血-再灌注损伤的机制仍需进一步的研究。

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（收稿日期：2017-11-17 本文编辑：张瑜杰）