明目地黄丸对糖尿病视网膜病变大鼠细胞自噬及Akt—mTOR通路的影响

徐赵钕　章仕淼　刘玲玲

[摘要] 目的 探讨明目地黄丸对糖尿病视网膜病变（DR）大鼠视网膜组织中细胞自噬及对Akt-mTOR信号通路的影响。 方法 采用高脂高糖饲料饲养联合腹腔注射链脲佐菌素（40 mg/kg）法制备DR大鼠模型，采用随机数字表法分为模型组、羟苯磺酸钙组（150 mg/kg）和明目地黄丸低（150 mg/kg）、中（300 mg/kg）、高（600 mg/kg）剂量组，每组10只，另设正常对照组10只，连续用药10周，监测各组大鼠体重及血糖。给药10周后，透射电子显微镜观察视网膜组织中细胞自噬小体数量；蛋白印迹法检测视网膜组织中自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白水平。 结果 与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织现空泡样变化、细胞排列稀疏紊乱等病理变化，自噬小体数目明显减少（P < 0.05），Beclin、LC3-Ⅱ蛋白表达明显下调（P < 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表达显著上调（P < 0.05）；与模型组比较，明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠视网膜组织病理变化均显著改善（P < 0.05），自噬小体数目显著增多（P < 0.05），Beclin、LC3-Ⅱ蛋白表达显著上调（P < 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显下调（P < 0.05），呈剂量依赖效应。 结论 明目地黄丸能抑制DR大鼠视网膜组织中细胞自噬过程，其機制可能通过Akt-mTOR信号通路调控自噬相关蛋白表达而实现。

[关键词] 明目地黄丸；糖尿病视网膜病变；细胞自噬；Akt-mTOR信号通路

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（b）-0016-06

Effects of Mingmu Dihuang Pills on autophagy and Akt-mTOR signaling pathway in retinal tissue of diabetic retinopathy rats

XU Zhaonü ZHANG Shimiao LIU Lingling

Department of Endocrinology， Wenzhou Central Hospital， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Mingmu Dihuang Pills on autophagy and Akt-mTOR signaling pathway in retinal tissue of diabetic retinopathy （DR） rats. Methods The DR rat model was prepared by high fat and high sugar feed combined with intraperitoneal injection of Streptozotocin （40 mg/kg） method， and they were divided into model group， Calcium Dobesilate group （150 mg/kg）， low （150 mg/kg）， medium （300 mg/kg）， high （600 mg/kg） dose of Mingmu Dihuang Pills groups by random number table method， with 10 rats in each group， and 10 rats were selected as normal control group， all the rats were given the medicine continuously for 10 weeks， the weight and blood sugar of the rats in each group were monitored. After 10 weeks of administration， the number of autophagic corpuscles in the retinal tissue was observed by transmission electron microscope； Western blot was used to detect autophagy related protein Beclin1， microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ （LC3-Ⅱ）， Akt， p-Akt， mTOR and p-mTOR protein in retinal tissue. Results Compared with the normal control group， the retina tissue of rats in the model group showed the changes of vacuoles， the cells arranged sparsely and disorder and so on， the number of autophagic corpuscles decreased significantly （P < 0.05）， the expression of Beclin and LC3-Ⅱ protein was obviously down-regulated （P < 0.05）， the expression of p-Akt and p-mTOR protein was significantly up-regulated （P < 0.05）； compared with the model group， the pathological changes of rats retina tissue in the low， medium and high dose of Mingmu Dihuang Pills groups were significantly improved （P < 0.05）， the number of autophagic corpuscles increased significantly （P < 0.05）， the expression of Beclin and LC3-Ⅱ protein was significantly up-regulated （P < 0.05）， the expression of p-Akt and p-mTOR protein was obviously down-regulated （P < 0.05）， in dose-dependent manners. Conclusion Mingmu Dihuang Pills can inhibit the process of autophagy in retinal tissue of diabetic retinopathy rats， and its mechanism may be achieved by the regulating the expression of autophagy related proteins through the Akt-mTOR signaling pathway.

[Key words] Mingmu Dihuang Pills； Diabetic retinopathy； Autophagy of cells； Akt-mTOR signal pathway

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是由于视网膜长期处于高糖环境，导致血-视网膜屏障被破坏，视网膜发生损伤的一种疾病，是糖尿病常见并发症之一[1]。随着糖尿病患者病程的增加和年龄的增长，DR的发生率逐渐增加。研究发现，自噬功能紊乱在糖尿病及其并发症的发生过程中具有重要作用，高血糖环境可抑制视网膜组织中细胞自噬作用，导致活性氧、晚期糖化终末产物等代谢产物累积，造成视网膜损伤[2]。中医认为，DR是由血瘀络阻、气阴双虚引起。明目地黄丸为我国特色中药制剂，以山茱萸、熟地黄、茯苓、山药、白芍等多味中药组成，具有养肝、滋肾、明目等药理活性[3-4]。临床应用多年，可有效减少糖尿病性视网膜病变患者出血斑面积及微血管瘤数，改善患者视力，临床疗效明确[5]，但其作用机制尚不清楚。本研究通过构建DR大鼠模型，观察明目地黄丸对DR模型大鼠视网膜组织中细胞自噬，以及对视网膜组织中Akt-mTOR信号通路的影响，试图揭示明目地黄丸改善DR的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 明目地黄丸：由山茱萸、熟地黄、茯苓、牡丹皮、山药、枸杞子、白芍等组成，北京同仁堂有限公司，批号：Z11020166。羟苯磺酸钙分散片，江苏万高药业有限公司，批号：H20130288。

1.1.2 动物 雄性健康SPF级SD大鼠，体重（180±10）g，7～8周，上海邦耀生物公司，合格证号：0150523。所有实验动物均于浙江省温州市中心医院（以下简称“我院”）实验动物中心常规饲养，自由饮水，饮食。所有实验均经我院动物实验伦理委员会批准。高糖高脂饲料及常规颗粒饲料，北京博奥派克生物公司。

1.1.3 试剂 链脲佐菌素（美国Sigma公司，批号：18883-66-4）；4%多聚甲醛（批号20150215）、戊二醛（批号：20160427）、戊巴比妥钠（批号：20160108）购自成都科龙化工试剂厂；DAB显色试剂盒（中杉金桥公司，批号：ZLI-9018）；Anti-Beclin、Anti-LC3-Ⅱ、Anti-p-Akt、Anti-Akt、Anti-p-mTOR、Anti-mTOR、Anti-GAPDH购自美国CST公司。

1.1.4 仪器 EM-1400透射电子显微镜（日本电子株式会社）；RM2165石蜡切片机（德国Leica公司）；LGJ100冷冻干燥机（美国松源华兴科技发展有限公司）；BHS-2普通光学显微镜（日本Olympus公司）；DYCP-31DN型蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）；1703940型转膜仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 采用高脂高糖饲料饲养联合腹腔注射链脲佐菌素（40 mg/kg）法制备DR大鼠模型。术前行常规血糖检测，入选大鼠血糖水平均正常。采用高脂高糖饲料饲喂造模大鼠，6周后，禁食12 h，给予大鼠40 mg/kg链脲佐菌素（溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液，新鲜配置）腹腔注射；正常對照组大鼠采用常规饲料饲养，注射等体积0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。72 h后，检测各大鼠空腹时血糖水平，以禁食4 h后血糖≥16.67 mmol/L的大鼠为糖尿病模型大鼠。糖尿病模型大鼠高脂高糖饲料饲喂4周后给予普通饲料饲养，正常对照组大鼠给予常规饲料饲养，每周记录大鼠摄食量、饮水量、体重及血糖水平，参照文献[6]对糖尿病模型大鼠进行DR模型评价。

1.2.2 动物分组及处理 经检测证实，本研究共计50只大鼠造模成功。采用随机数字表法分为模型组、羟苯磺酸钙组和明目地黄丸低、中、高剂量组，每组10只，另设正常对照组。明目地黄丸低、中、高剂量组每天按时予明目地黄丸150、300、600 mg/（kg·d）灌胃治疗；羟苯磺酸钙组予羟苯磺酸钙150 mg/（kg·d）灌胃治疗；正常对照组及模型组予等量生理盐水灌胃，药物处理期间，第4、8、10周定期检测大鼠体重及血糖水平。灌胃给药10周后，给予大鼠2.5%戊巴比托腹腔注射麻醉，腹主动脉取血至动物休克，迅速取出大鼠的眼球视网膜组织，分成3份，一份置于4%多聚甲醛中固定，制备石蜡切片，用于HE染色；一份置于4%戊二醛中固定，用于病理形态学观察；一份置于液氮中速冻，-70℃保存。

1.2.3 苏木精-伊红（HE）染色法观察视网膜形态 对“1.2.2”项中大鼠视网膜组织石蜡切片进行脱蜡、水化处理。按照HE法染色流程对切片进行染色，中性胶封片，置于光学显微镜下，观察大鼠视网膜组织形态并拍照。

1.2.4 透射电子显微镜（TEM）观察视网膜组织中细胞自噬 将“1.2.2”项中4%戊二醛固定的大鼠视网膜组织，按照文献[7]中的方法制备透射电镜标本。置于透射电子显微镜下观察视网膜组织中细胞自噬小体并拍照。每个视网膜组织标本随机选取10个视野，计数自噬小体的数量并进行比较。

1.2.5 蛋白印记（Western blot，WB）法检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平 将“1.2.2”项中大鼠视网膜冷冻组织在液氮中研磨，加入1.2 mL蛋白裂解液（含protease inhibitor），提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白总量。SDS-凝胶电泳后，半干转印至PVDF膜上；5%脱脂奶粉，封闭1 h；分别加入一抗Anti-Beclin、Anti-LC3-Ⅱ、Anti-p-Akt、Anti-Akt、Anti-p-mTOR、Anti-mTOR、Anti-GAPDH（1∶500），4℃孵育过夜；加入二抗（1∶5000），室温孵育1 h。经化学发光法进行检测，Tanon软件拍摄图像并进行半定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较行单因素方差分析，两两比较行S-N-K法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 明目地黄丸对大鼠体重、血糖的影响

药物处理前，模型组大鼠体重、血糖水平均显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；模型组、羟苯磺酸钙组和明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠体重、血糖水平之间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。药物处理10周后，与模型组比较，羟苯磺酸钙组和明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠体重、血糖水平无显著变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 明目地黄丸对大鼠视网膜组织结构的影响

如图1所示，正常对照组大鼠视网膜组织结构完整，层次清晰，细胞排列规则有序；与正常对照比较，模型组大鼠视网膜组织现空泡样变化，细胞排列稀疏紊乱，毛细血管扩张充血明显；药物作用10周后，明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠视网膜细胞组织结构恢复完整，细胞排列基本规则，可见少量毛细血管扩张充血。

2.3 明目地黄丸对大鼠视网膜组织细胞自噬的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中自噬小体数量明显减少（P < 0.05）；药物作用10周后，与模型组比较，明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠视网膜组织中自噬小体数量显著增加（P < 0.05），呈剂量依赖效应。见图2、表2。

2.4 明目地黄丸对大鼠视网膜组织中LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；药物作用10周后，与模型组比较，明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠视网膜组织中LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表达水平均显著升高（P < 0.05），呈剂量依赖效应。见图3、表3。

2.5 明目地黄丸对大鼠视网膜组织中Akt-mTOR信号通路的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中Akt、mTOR蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。药物作用10周后，与模型组比较，明目地黄丸低、中、高剂量组大鼠视网膜组织中Akt、mTOR蛋白表达水平无明显变化（P > 0.05），p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均显著降低（P < 0.05），呈剂量依赖效应。见图4、表4。

3 讨论

糖尿病患者的视网膜组织长期处于高糖环境中，血-视网膜屏障受到损伤，导致毛细血管基底膜增厚，内皮细胞过度增殖，血管内皮细胞连接减弱，伸缩性降低，通透性增高，导致毛细血管闭塞，加剧糖尿病患者视网膜病变[8-10]。明目地黄丸因其养肝、滋肾、明目等作用，被广泛应用于治疗各种眼科疾病、脑血管病、糖尿病等内分泌疾病疾病[11]。本研究发现，造模期间，模型组大鼠体重明显降低，血糖显著升高。明目地黄丸干预10周后，与模型组比较，明目地黄组大鼠体重、血糖水平无显著变化，提示明目地黄丸无显著降血糖作用。视网膜HE染色结果显示，明目地黄丸干预后，不同程度地减轻糖尿病大鼠视网膜组织病理损伤，不同程度地改善毛细血管充血情况，细胞排列逐渐规则，视网膜结构趋于完整，提示明目地黄丸通过改善视网膜微循环，促使視网膜血流通畅，而达到减轻或清除视网膜毛细血管渗漏和视网膜水肿的目的，从而实现对糖尿病大鼠视网膜组织损伤的保护作用，改善视网膜病变。

自噬是真核细胞特有的一种防御保护机制，自噬在应对细胞氧化应激及机体能量失衡导致的高胰岛素血症等生物过程中发挥重要作用，高糖高脂环境导致自噬作用的抑制，参与2型糖尿病和DR的发生[12-13]。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是一种重要的自噬相关蛋白，当自噬发生时，LC3-Ⅰ负责招募自噬相关蛋白至自噬小体，LC3-Ⅱ则始终定位在自噬体膜的表面，因此LC3-Ⅱ可作为细胞自噬开始的标志物，其表达水平可反映细胞自噬程度[14]。Beclin 1蛋白可结合PI3K、Vps34等自噬相关蛋白形成复合物，参与调解自噬小体的形成，诱导自噬的发生，因此Beclin 1是一种调控自噬的关键蛋白[15]。Dehdashtian等[16]发现，自噬、氧化应激、炎症及内质网应激在糖尿病相关并发症的主要致病因素，可导致线粒体中电子传递链障碍、细胞中活性氧累积，视网膜毛细血管黏附等病变。本研究发现，DR模型组大鼠视网膜组织中自噬小体数量显著低于正常对照组，明目地黄丸干预10周后，DR大鼠视网膜组织中自噬小体数量显著增加，呈剂量依赖效应。进一步研究显示，DR模型组大鼠视网膜组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达水平显著下调，明目地黄丸干预10周后，LC3-Ⅱ、Beclin蛋白表达水平显著上调，呈剂量依赖效应。以上结果提示，高糖可诱导大鼠视网膜细胞自噬功能障碍和溶酶体损伤，导致有害物在细胞内积累，抑制视网膜细胞自噬相关蛋白的表达和自噬小体的形成，导致DR的发生，而明目地黄丸则可逆转这一抑制作用，促进自噬小体的形成，提示明目地黄丸对DR的修复作用可能与细胞自噬有关。

Akt/mTOR信号通路是由激酶级联反应介导的信号传导通路，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt通过协同磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶作用，促进Akt由胞浆转移至细胞膜，发生磷酸化而激活，激活的Akt可进一步促进其下游蛋白mTOR的磷酸化，从而激活靶基因转录，参与细胞分化、凋亡、自噬、血管形成等生理过程[17-18]。Poornima等[19]研究证实，荷花碱可剂量依赖地抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，进而促进肺癌细胞的自噬作用。本研究发现，与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中Akt、mTOR蛋白总表达情况无明显变化，但p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著上调；明目地黄丸治疗后p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显下调，对Akt、mTOR蛋白总量没有影响，提示明目地黄丸具备抑制Akt-mTOR信号通路的可能，推测明目地黄丸可能通过抑制Akt-mTOR信号通路，促进细胞自噬，发挥对糖尿病大鼠视网膜病变的修复作用。

综上所述，明目地黄丸可能通过抑制Akt-mTOR信号通路促进自噬小体形成，发挥对糖尿病所致视网膜损伤的保护作用。

[参考文献]

[1] Guthrie MJ，Osswald CR，Kang-Mieler JJ. Inverse relationship between the intraretinal concentration of bioavailable nitric oxide and blood glucose in early experimental diabetic retinopathy [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2014，56（1）：37-44.

[2] Rosa MD，Distefano G，Gagliano C，et al. Autophagy in Diabetic Retinopathy [J]. Curr Neuropharmacol，2016，14（8）：810-825.

[3] 赵艳青，李青松，项敏泓，等.糖尿病视网膜病变中医证候分布规律及症状相关性研究[J].中国中药杂志，2017， 42（14）：2796-2801.

[4] 李赛，李东.杞菊地黄丸与明目地黄丸的临床应用辨析[J].中华中医药杂志，2013，28（7）：2186-2188.

[5] 汪洋.明目地黄丸和三七血伤宁胶囊联合西医治疗非增殖期2型糖尿病性视网膜病变的观察[J].中国中医急症，2016，25（12）：2345-2348.

[6] 高玉，吴晋晖，柳林.链脲佐菌素诱发性糖尿病大鼠早期视网膜病变模型的建立[J].第二軍医大学学报，2010，31（10）：1053-1059.

[7] 翟晶，王艳红，高明堂，等.蛇葡萄素钠对肿瘤细胞及正常细胞毒性作用的比较[J].中药药理与临床，2016，32（4）：8-12.

[8] Ogurtsova K，da Rocha Fernandes JD，Huang Y，et al. IDF Diabetes Atlas：Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040 [J]. Diabetes Res Clin Pract，2017，106（2）：40-50.

[9] 应佳，李俊，俞颂平，等.白藜芦醇软胶囊在糖尿病患者早期视网膜病变治疗中的价值及对血糖的影响[J].中国现代医生，2017，55（6）：4-7.

[10] 朱华，李彦红，徐艳峰，等.小剂量多次注射链脲佐菌素建立糖尿病早期视网膜病变动物模型[J].中国实验动物学报，2016，24（5）：487-493.

[11] 张蕙，张荣春，倪诚.地黄类中成药临床应用辨析[J].中华中医药杂志，2013，28（7）：2178-2181.

[12] 徐月圆，刘淼，李颖洁，等.玻璃体腔注射雷珠单抗治疗早产儿视网膜病变的应用研究[J].中国现代医生，2017， 55（33）：73-75，封3.

[13] Munasinghe PE，Riu F，Dixit P，et al. Type-2 diabetes increases autophagy in the human heart through promotion of Beclin-1 mediated pathway [J]. Int J Cardiol，2016，36（202）：13-20.

[14] Mehta P，Henault J，Kolbeck R，et al. Noncanonical autophagy：one small step for LC3，one giant leap for immunity [J]. Curr Opin Immunol，2014，26（2）：69-75.

[15] Hiroshi K，Kentaro N，Sultana R，et al. Loss of autophagy-related protein Beclin 1 may define poor prognosis in ovarian clear cell carcinomas [J]. Int J Oncol，2015，47（6）：2037-2044.