辛温通阳中药对急性心肌缺血大鼠的保护作用及机制研究

雷杰，段刚峰，郑琼莉

(武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022)

心肌缺血是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)的病理状态，冠状动脉粥样硬化或痉挛是其主要病因，急性发作死亡率高。CHD的发病率呈逐年上升的趋势，严重危害着人类健康[1]。中医学将冠心病归属于“胸痹”等证范畴，早在《黄帝内经》中就记载了“心病先心痛”“真心痛，手足青至节……旦发夕死，夕发旦死”。汉代医家张仲景详细论述胸痹的病因病机，首创胸痹的辨证论治，指出“夫脉当取太过不及，阳微阴弦，即胸痹而痛”，明确了病机为“阳微阴弦”，即阳气不通，痰瘀痹阻心脉，并创立了瓜蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤等辛温通阳的代表方，而薤白、附子、干姜、桂枝则是辛温通阳的代表中药。前期研究证实[2-5]，辛温通阳中药能降低血清C反应蛋白(CRP)和一氧化氮(NO)水平、减少血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)含量、清除血清超氧化物歧化酶(SOD)、MDA，增加心肌灌注等作用。受仲景思想之启迪，结合现代医学对心肌缺血损失的认识，本课题组拟复制急性心肌缺血大鼠模型，探讨辛温通阳中药对模型大鼠的保护作用及机制，以期为心血管疾病的治疗提供新思路。

1 材料

1.1 实验动物

SD雄性大鼠(SPF级)70只，体质量(200±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证编号：HNASLKJ20100977。

1.2 实验药物与试剂

2.6%薤白提取物混悬液(批号091101)、1.9%桂枝提取物混悬液(批号091105)、0.9%干姜提取物混悬液(批号091009)、3.2%附子提取物混悬液(批号091103)(什邡市巨邦植物原料有限公司)；1.6%硝酸甘油混悬液(批号905028KL，齐鲁制药有限公司)；无水乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、4%多聚甲醛、二甲苯(武汉宇阳锋锐生物科技有限公司)；戊巴比妥钠(批号30037523，上海国药集团化学试剂有限公司)；0.9% NaCl溶液(批号20130126，山东康宁药业有限公司)；T-AOC、GSH-Px、MDA、MPO测试盒，IL-10、IL-6、TNF-α Elisa试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 实验仪器

ECG-6951D型心电图机(上海光电子仪器有限公司)；XSP-BM-30AC电脑型生物显微镜(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司)；16C14型721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；Tekmar组织匀浆机(美国Teledyne Tekmar公司)；powerlab/8s型八导数据分析仪(澳大利亚埃德公司)；MDF-390ATYO超低温冰箱(日本SANYO公司)；HX200型动物人工呼吸机(成都春盟科技有限公司)。

2 方法

2.1 实验分组

70只大鼠用随机数表分为7组，每组10只：假手术组、模型组、薤白组、附子组、干姜组、桂枝组、硝酸甘油组。

2.2 模型制备

大鼠经适应性喂养1周后进行腹腔注射麻醉(3.5%戊巴比妥钠，35 mg/kg)，仰位固定，将大鼠与数据分析记录仪(powerlab/8s型)连接好，记录一段正常心电图后开胸。随后将大鼠气管切开插管，连接动物微量呼吸机(10×60 ml/min持续进气)，通过开胸结扎左冠状动脉前降支，复制急性心肌缺血模型。具体如下：胸部去毛，消毒，沿左胸骨中线切开线形皮肤口约2 cm，于第4肋间开胸，扩胸，去掉心包膜，暴露出心脏，在左冠状动脉起始下约2 cm(即左心耳根部与肺动脉圆锥交界处)，用细线结扎(假手术组只置手术线而不结扎)。心电监护见Ⅱ导联提示ST段显著抬高，证明结扎成功。

2.3 给药方法

造模完成后，在大鼠腹部正中线偏左开口，找到十二指肠，结扎5 min后，用注射器给药，薤白组、干姜组、附子组、桂枝组按600 mg/kg给药；硝酸甘油组按80 mg/kg给药，假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水，给药体积为2 ml/kg。

2.4 取材

给药3 h后观测心电图，后立即以血管钳暂时夹闭大鼠胸壁。快速行大鼠腹主动脉取血，立即将其中2 ml血注入含有10%EDTA二钠30 μl和胰肽酶40 μl的试管中，混匀，离心(4℃，3 000 rpm 10 min)，取上清，放置于-70℃冰箱中保存待测。取血完成后立即取下大鼠心脏置于冰生理盐水里，洗净心脏组织，剪取左心室心尖组织冻存，用于心肌MPO活性检测和组织病理切片制作。

2.5 指标检测

2.5.1 大鼠心电图Ⅱ导联ST段变化

采用心电图机标准心电图Ⅱ导联检测(标准电压0.1 mv，走纸速度50 mm/s),分别记录结扎前10 min与结扎后3 h心电图ST段变化，计算ST段抬高的均数。

2.5.2 大鼠心肌组织病理形态学观察

取心尖缺血的心肌组织，将心肌组织标本用4%多聚甲醛固定24 h，先后用70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水，经二甲苯透明，再用蜡块包埋，最终制成石蜡切片(5 μm)，行HE染色，观察心肌组织形态学变化。

2.5.3 大鼠血清氧化应激指标的测定

GSH-Px活性测定采用比色法；MDA水平测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；T-AOC活性测定采用铁还原法。具体操作按试剂盒说明书进行。

2.5.4 大鼠炎症因子的测定

采用ELISA双抗体夹心法检测大鼠血清IL-10、IL-6及TNF-α水平。MPO活性测定方法如下：将心肌组织称重,按1∶18的重量体积比，加匀浆递质，制成匀浆(5%),然后加入显色剂、H2O2，水浴后马上在分光光度计460 nm处测定A值。具体操作步骤参照MPO测试盒说明。MPO以37℃反应体系中H2O2被分解1 μmol为1个活力单位。

MPO(IU/g)=(测定管A值-对照管A值)/11.3×取样量(g)

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠急性心肌缺血损伤心电图ST抬高水平的比较

与假手术组比较，模型组ST段上移明显，提示造模成功；与模型组比较，中药组与西药组ST段抬高均显著低于模型组(P<0.05，P<0.01) ，提示各辛温通阳中药能减轻大鼠急性心肌缺血损伤，各药物组间比较差异无统计学意义。结果见表1。

表1 辛温通阳中药对急性心肌缺血大鼠心电图ST段的影响

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各组大鼠心肌组织病理形态学的比较

HE染色结果显示：假手术组心肌组织结构完整，大部分心肌纤维结构正常，成束排列，心肌细胞整齐，细胞核为椭圆形，位于细胞中央，肌纤维间散在毛细血管；模型组心肌纤维排列紊乱，心肌纤维断裂、肿胀，可见小灶性肌纤维坏死，肌纤维间毛细血管扩张充血伴炎性细胞浸润；薤白组心肌纤维部分断裂，肌纤维间毛细血管轻度扩张，偶见炎性细胞浸润；干姜组心肌纤维排列较为整齐，少数肌纤维断裂，可见心肌细胞坏死并伴有中性粒细胞浸润及毛细血管扩张充血；附子组、桂枝组心肌纤维排列较为整齐，少数心肌纤维断裂，仅见一部分心肌肿胀，结构模糊，肌纤维间毛细血管扩张充血不明显；硝酸甘油组肌纤维排列整齐，极少数肌纤维断裂，肌纤维间少数毛细血管扩张充血，无明显炎性细胞浸润。 结果见图1。

3.3 各组大鼠急性心肌缺血损伤氧化应激指标的比较

与假手术组比较，模型组T-AOC、GSH-Px的活性明显降低 (P<0.01)，而MDA 的水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，中药组与西药组均能显著升高血清T-AOC及GSH-Px 的活性(P<0.05，P<0.01)，明显降低MDA水平(P<0.05，P<0.01)。组间比较，薤白组较其余各组T-AOC升高更显著(P<0.05)；干姜组较其它药物组MDA水平较高(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义。结果见表2。

图1 大鼠急性心肌缺血损伤心肌细胞组织病理学观察(HE染色，200×)

表2 辛温通阳中药对大鼠急性心肌缺血血清氧化应激的影响

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 各组大鼠血清炎症指标的比较

与假手术组比较，模型组血清IL-6、TNF-α水平及MPO活性明显升高(P<0.01)，血清IL-10显著降低(P<0.01)；与模型组比较，辛温通阳各组均能降低IL-6、TNF-α水平及MPO活性(P<0.05，P<0.01)，相应地增加IL-10的水平而减轻炎症细胞浸润程度(P<0.05，P<0.01)；组间比较，薤白组与桂枝组对IL-10升高更加明显(P<0.05)，二者之间无统计学差异(P>0.05)；各药物组IL-6、TNF-α水平无显著性差异(P>0.05)；附子组MPO活力较高(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义。结果见表3、图2。

表3 辛温通阳中药对大鼠急性心肌缺血损伤炎症反应的影响

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：A.假手术组；B.模型组；C.薤白组；D.附子组；E.干姜组；F.桂枝组；G.硝酸甘油组。图2 辛温通阳中药对大鼠急性心肌缺血损伤炎症反应的影响

4 讨论

冠心病急性心肌缺血是临床常见病和多发病，90%的发病原因是由于冠状动脉粥样硬化所引起的，结果造成心肌处于一种缺血、缺氧的病理状态。目前认为其机制主要包括两个方面：1)氧化应激[6]：氧自由基产生过多，清除能力下降，导致氧化系统与抗氧化系统失衡，活性氧被大量产生，一方面直接通过氧化还原反应损伤生物膜，另一方面间接地激活中性粒细胞引起细胞内Ca2+超载。在氧化应激过程中，GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，可以使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，保护细胞膜的结构及功能[7]。而MDA是脂质过氧化的一个重要指标，MDA的产生会加剧细胞膜的损伤[8]。T-AOC反映出机体抗氧化能力的水平[9]。2)炎性因子[10]：炎症可产生大量的NO导致组织损伤，进而引起内皮损伤，加速冠脉粥样硬化的形成。白细胞介素又参与人体免疫反应的调节与表达[11]，其中IL-6可促进炎性介质直接作用于血管壁，改变其通透性，损害心肌组织；IL-10能够降低促炎性细胞因子的产生并具有免疫抑制作用；MPO涉及到动脉粥样硬化的所有阶段，可引起内皮细胞功能损伤，与冠脉疾病密切相关[12]。TNF-α可损伤血管内皮细胞，导致血管损伤和血栓形成[13]。

中医学中无急性心肌缺血的概念，据其临床症状多归属于“心痛”“胸痹”“真心痛”等范畴。“胸痹”病名首见于《黄帝内经》，至汉代张仲景加以丰富，明确了胸痹乃上焦阳气不足，下焦阴寒气盛的本虚标实之证，并确立了辛温通阳的治疗大法。中医学理论中对阳气较为重视，《素问·生气通天论》载：“阳气者，若天与日，失其所，则折寿而不彰”[14]。人之阳气就如同日光，太阳主宰自然界生物的生长发育，人之阳气则主宰着我们机体生命活动的全过程。阳气同时又以“通”为用，叶天士言:“阳气窒闭，浊阴凝痞”，具体来讲即是阳气不通，从而导致浊阴凝聚，痞塞壅滞[15]。“心为火脏，烛照万物”，心以阳气用事，阳气不通，痰瘀痹阻则导致心肌缺血，针对此证，叶氏提出“通阳必以辛热”[16]。薤白、附子、干姜、桂枝作为辛温通阳中药的代表，在心血管疾病的防治中发挥了重要作用。《本草图经》记载：“薤，味辛则散， 散则使在上寒滞消……瘀血可散，胸痹刺痛可愈。”《本草新编》言：“细辛阳药也……善降浊气而升清气。” 而桂枝又具辛温之性，能温通经脉、通阳化气；干姜“通心助阳”“去脏腑沉寒痼冷”，善发诸经之寒气[17]。现代药理学研究也发现，薤白对心肌损伤具有保护作用，能够扩张血管、 抑制凝血和抗血栓[18]。桂枝所含桂皮醛、桂皮酸钠具有扩张血管、抗血小板聚集、抗凝血作用[19]。干姜内所含姜烯酚等活性物质具有兴奋心脏，扩张血管，抗血小板聚集等作用[20]。附子煎剂则具有明显的强心作用，能够加强心肌收缩力，增加收缩幅度和频率[21]。

通过本实验，我们发现心肌缺血后的大鼠从心电图显示ST段明显抬高，与模型组相比，病理形态HE染色显示，各辛温通阳中药组心肌损伤程度下降，血管扩张和炎性浸润也相应减少。从氧化应激和炎症因子角度分析，较模型组而言，各辛温通阳中药组能显著升高血清T-AOC及GSH-Px活力，降低MDA的水平，并能降低IL-6、TNF-α浓度及MPO活力，增加IL-10的水平从而减轻炎症细胞浸润程度，说明辛温通阳中药对急性心肌缺血大鼠具有保护作用。

综上所述，薤白、附子、干姜、桂枝这些辛温通阳中药能够起到保护急性心肌缺血大鼠心肌损伤的作用，其机制可能与调控氧化应激，抑制脂质过氧化，降低相关炎性细胞或因子的释放有关。