小米中黄酮类化合物的提取研究

雷金仙，渠星宇，刘秀萍

(晋中学院，山西 晋中 030600)

0 引言

小米具有丰富的营养价值，它含有多种脂肪、蛋白质、维生素等，能抵抗癌症；含有丰富的膳食纤维，有助于提高消化功能；富含铁、磷等，具有补血健脑的功效。用小米酿酒还有滋阴补肾、抗衰护心等功效。此外，值得关注的是小米中含有黄酮类化合物。

黄酮类化合物是一类具有酮羰基的化合物，分子中有2个由3个中央碳原子连接的苯环(A环和B环)。黄酮类化合物有降低血脂和胆固醇的功能，具有抵抗病毒、美容保健等作用[1]。许多植物中含有黄酮，如银杏叶、刺梨、柑橘、槐米花、黄芩以及豆类等杂粮。山西隶属黄河流域，盛产优质黄小米。提取黄酮的传统方法有很多，如直接提取法、碱萃取、酸沉、溶剂法等[2]。近年又出现了一些新的黄酮提取方法，如超声波提取法[3]、微波提取法等。其中，溶剂法是提取黄酮类化合物最常用的一种方法，提取剂常用乙醇。溶剂法的优点是设备简单、安全、适合大量物料的提取，但消耗时间长，提取液不太纯，提取效率较低[4]。微波提取法是利用高频电磁波辐射物料，微波能被物料吸收，细胞的温度会迅速上升，压力增大，导致细胞破碎，内部的有效成分流出，并溶解于萃取介质中，再进行过滤和分离操作，即可获得所需的萃取物。微波提取法的优点是物料受热均匀、操作时间短、溶剂消耗量少、萃取效率高[5]。超声波提取法是利用超声波产生一个高于20 kHz的超音频电信号，使物料分子的运动速率加快，分子之间震动、撞击，并迅速溶解在提取液中。该方法提取时间短，提取所用温度不必太高，提取率高。本研究采用超声波提取法、微波提取法、溶剂法这3种技术对小米中黄酮类化合物进行提取[6-8]，并对这3种方法进行比较，探究最有效的提取方法以及最佳提取条件。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(均为分析纯)、芦丁(生化试剂)、小米(山西晋中榆社，用研钵研成粉末状使用)。

1.2 实验仪器

电子恒温水浴锅(金坛市恒丰仪器厂)、XYJ-802离心沉淀机、微波炉、循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、KQ-200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、V-1200可见分光光度计。

1.3 实验方法

本文利用黄酮类化合物与铝盐的显色反应，用光度法测量黄酮的含量。

1.3.1 标准曲线制作

将芦丁标准品0.012 5 g置于烧杯中，加入60%乙醇，溶解于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液，每1 mL含无水芦丁0.25 mg。取6个25 mL容量瓶，分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准液，再各加入5% NaNO20.7 mL，摇匀，放置5 min，然后再分别加入10% Al(NO3)30.7 mL，摇匀，放置5 min，再各加入1 moL/L NaOH 5 mL，再加入60%乙醇，定容，摇匀，静置15 min。在510 nm处测量各溶液的吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，标准曲线如图1所示。

图1 芦丁的标准曲线

1.3.2 小米中黄酮提取过程

将小米粉碎研磨，称取5.0 g小米粉末放入100 mL圆底烧瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液50 mL，在一定温度、一定时间下，分别用溶剂法、微波提取法、超声波提取法提取小米中的黄酮，抽滤离心后获得提取液。

1.3.3 小米中黄酮类化合物的含量测定

准确量取提取液5.0 mL，移入25 mL容量瓶中，加入5% NaNO20.7 mL，摇匀，放置5 min后，加入10% Al(NO3)30.7 mL，摇匀，放置5 min，然后加入1 moL/L NaOH 5 mL，再加入60%乙醇，定容，摇匀，静置15 min。以试剂空白为参比，在510 nm处测定吸光度，根据回归方程求出浓度，并计算提取液中黄酮含量。提取率e=CαV/m，其中：C为在标准曲线上求得的黄酮的质量浓度，单位为mg/mL；V为提取液体积，单位为mL;m为提取所用小米的质量，单位为g;α为稀释倍数。

2 提取条件的研究

2.1 乙醇浓度对黄酮提取的影响

称取5份5.0 g小米粉末分别放入5个圆底烧瓶中，再分别加入体积分数为20%、40%、60%、80%、100%的乙醇各50 mL，将其置于60 ℃恒温水浴箱中，溶剂浸提2 h。同样取5份小米粉末，加入同样的乙醇量，放入微波炉中，用微波协助提取。微波炉温度设置为60 ℃，提取时间4 min。另外5份小米乙醇试样，采用超声法提取法。超声波功率在预定实验中经过初步筛选，选定为160 W，温度50 ℃，提取时间为30 min。抽提完成后，趁热抽滤提取液，分别测量其吸光度。结果如图2所示。

图2 不同方法乙醇浓度对黄酮提取的影响

由图2可见，对于3种提取方法，乙醇的浓度影响存在相同的规律，即随着乙醇体积分数的增加，提取液的吸光度不断上升，说明黄酮浓度增加，但当乙醇的体积分数超过60%时，吸光度下降，说明黄酮浓度下降。这是由于当乙醇浓度较低时，主要是以水为提取溶剂，此时如一些多糖的水溶性杂质也被溶解，使得黄酮类化合物的浓度减小，随着乙醇浓度的增加，溶剂极性逐渐变小，根据相似相容原理，弱极性的黄酮化合物能充分溶解，黄酮浓度上升，当乙醇浓度继续增大，水的比例减小，溶剂的极性继续降低，一些亲脂性成分及醇溶性杂质溶解增多，导致黄酮类化合物的浓度减小。从实验结果看，适宜提取黄酮的乙醇溶剂的体积分数为60%。

2.2 温度对黄酮提取的影响

称取6份5.0 g小米粉末于圆底烧瓶中，分别加入50 mL体积分数为60%的乙醇溶液，置于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃的恒温水浴箱中，进行溶剂抽提2 h。取5份小米粉末，分别加入60%的乙醇溶液50 mL用于进行微波提取。微波炉温度分别设置为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，提取4 min。再取6份小米粉末，分别加入60%的乙醇溶液50 mL，用于超声波提取，设置温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，提取30 min。提取完成后，趁热抽滤提取液，分别测量其吸光度，结果如图3所示。

图3 不同方法温度对黄酮提取的影响

由图3可见，初始阶段随着提取液温度的升高，吸光度也随之升高。这是因为随着温度升高，分子运动速度加快，渗透扩散、溶解速度加快，有助于黄酮在溶剂中的溶解。达到一定温度后，采用溶剂法和超声波提取法吸光度以平缓的速度下降，采用微波提取法吸光度下降幅度最大，这是由于微波对物质的作用力明显强于溶剂法和超声波提取法，在微波的作用下，细胞结构改变，从而导致物质光学性质改变，同时一些非黄酮物质的溶解度也可能增大，多种因素导致黄酮浓度降低。3种方法的最佳提取温度为：溶剂法70 ℃，微波提取法、超声波提取法50 ℃。

2.3 时间对黄酮提取的影响

采用与上文相同的方法，分别设定溶剂法提取温度为70 ℃，微波提取法温度为60℃，超声波提取法温度为50 ℃，考察时间对3种提取方法的影响，结果如图4所示。

(a)溶剂法

(b)微波提取法

(c)超声波提取法

由图4可知，在最初阶段，提取物的吸光度随着时间的增加而显著增加。之后，溶剂法与超声波提取法对提取时间的影响结果表现较类似，即继续延长时间对提高吸光度的效果甚微。对微波提取法来说，进一步延长时间，反而会使吸光度急速下降，这可能是由于：①原料和提取液两个体系间存在浓度差导致随着时间的增加提取率增加，但达到一定时间后，两体系达到平衡状态，黄酮不再继续溶出；②随着时间的增加，微波作用容易使黄酮结构遭到破坏。在3种方法中，微波提取法的提取时间是最短的，只有短短几分钟，其他2种方法的提取时间则要长得多。3种方法的最佳提取时间分别为：溶剂法2 h，微波提取法4 min，超声波提取法30 min。

2.4 3种提取方法的比较

分别在3种提取方法的最佳条件下提取小米中的黄酮，测量提取液的吸光度，根据1.3.1中采用芦丁标准曲线回归方程和1.3.3的黄酮提取公式计算提取率。

结果表明，超声波提取法提取率最高，在60%的乙醇、50 ℃、160 W的条件下提取30 min，提取率达到0.189 mg/g。微波提取法提取率次之，在60%的乙醇、50 ℃的条件下，提取4 min，提取率为0.174 mg/g。溶剂法的提取率比较低，在60%的乙醇、70 ℃的条件下，提取2 h，提取率为0.146 mg/g。从提取的时间看，传统的溶剂法效率最差，耗时最长，同时提取温度也最高。微波提取法功效最强，所用提取时间最短，对时间也最为敏感，稍稍延长时间都会对黄酮的结构造成破坏。

3 结论

采用溶剂法、微波提取法、超声波提取法对小米中黄酮类化合物进行提取，发现超声波提取法提取率最高，在60%的乙醇、50 ℃、160 W的条件下提取30 min，提取率为0.189 mg/g。微波提取法次之，溶剂法的提取率最低，微波提取法和超声波提取法相对于溶剂法提取小米中的黄酮消耗时间短，提取效率高。