水禽源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及致病性观察

蔡双双 ， 刘晓丽 ， 段圣洁 ， 谷长勤 ， 程国富 ， 胡薛英

(1.湖北三峡职业技术学院 ， 湖北宜昌443000 ; 2.华中农业大学动物医学院 ， 湖北武汉430070)

肺炎克雷伯菌是引起人类获得性肺炎的常见致病菌，多引起新生儿呼吸道和泌尿系统的感染，它是一种条件致病菌，主要存在于动物和人的呼吸道以及肠道。肺炎克雷伯菌引起仔猪、牛、鸡、鸭、鹅等动物的疾病报道较多，另据报道一些水生动物、水貂等野生动物[1-4]因肺炎克雷伯菌感染发病。由于肺炎克雷伯菌可以感染人和多种动物，引起多种疾病，所以对肺炎克雷伯菌的研究，无论是对疾病的控制，还是对养殖业的可持续发展和社会的公共卫生都具有重要的意义。

本试验通过对湖北和广西两地疑似感染病鸭和鹅体内分离细菌进行了分离培养鉴定，并进行了致病性动物试验，为肺炎克雷伯菌的流行病学诊断提供了依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 湖北和广西2地养殖场疑似感染病鸭和病鹅；昆明系小鼠48只，购自华中农业大学实验动物中心。

TSA培养基、TSB培养基，均购自BD公司；无支原体胎牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；抗菌药物药敏试纸片、肠杆菌细菌生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；蛋白酶K，购自博能生物科技有限公司；核酸分子量标准物，购自宝生物工程(大连)有限公司；dNTP、 Mixes、TaqDNA Polymerase，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Gold-ViewTM，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2 病原菌的分离与培养 取患病动物眼睑、心、肝、肺、脑组织，采用无菌操作方法，用接种环取病料划线接种在TSA培养基和麦康凯培养基，置于37 ℃温箱中，培养24～48 h后，观察细菌生长情况。

挑取典型菌落传代接种于TSB培养基，观察细菌生长情况，并取典型的单个菌落做细菌涂片，革兰染色、镜检，观察纯培养菌的形态特征。

1.3 病原菌的生化试验 将纯化后的细菌按常规方法接种于杆菌生化试验微量发酵管(侧金花盏醇、山梨醇、硫化氢、葡萄糖酸盐、半乳糖酸盐、七叶苷、阿拉伯糖、枸橼酸盐、棉子糖、葡萄糖、木糖)，37 ℃培养48 h，观察并记录结果。

1.4 病原菌的16S rRNA序列测定及分析 设计并合成引物，上游引物R：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物F：5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其扩增的预期片段大小为750 bp。

按常规方法将菌体接种于加血清的TSA培养基上，37 ℃培养24 h，用生理盐水收集细菌的菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海天根生化科技有限公司)，按其说明书进行基因组DNA提取。

把提取的细菌基因组DNA作为模板，采用25 μL反应体系，条件稍有改动，Mix 12.5 μL、pw 9.5 μL、DNA模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL。反应条件：95 ℃5 min，94 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃90 s，共35个循环，72 ℃8 min，4 ℃保存。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，取未纯化的PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.5 药敏试验 药敏试验采用常规纸片法操作，操作方法和试验结果标准参照所购肠杆菌科说明书。

1.6 分离菌对小鼠的致病性观察 用灭菌生理盐水配制分离菌的细菌浓度为2×109CFU/ mL菌悬液备用。

成年昆明系小鼠48只，经血液检查无细菌感染后，随机分为8组，每组6只，试验组1～7组经腹腔注射途径分别接种7株分离菌菌悬液，每只0.3 mL。对照组经相同的途径接种0.3 mL灭菌生理盐水。感染后常规饲养管理。

感染后观察记录试验小鼠的临床症状、死亡时间和死亡数，对死亡的小鼠立即进行剖检，取心，肝部位做细菌分离鉴定，观察死亡小鼠的病理变化。感染7 d后，对试验小鼠全部进行剖检，观察各组织脏器的病理变化并统计死亡数量。

2 结果

2.1 病原菌的分离与培养结果 从疑似感染病鸭和鹅的肝、心等组织中分离到细菌，经过初步分离纯化后，分离到7株细菌，分别命名为20130116DY株、20130410SK株、 20130519DY株、20130521HX株、20130521XT株、20150113MC株、20150113XY株。

7株细菌生长的营养要求不高，在TSA培养基上生长良好，可以形成直径<1 mm的浓厚、半透明、浅白色、圆润、凸起、表面湿润的菌落。麦康凯培养基上生成红色菌落。分离菌经革兰染色镜检结果显示,分离菌均为革兰阴性短杆菌。

2.2 病原菌的生化试验结果 细菌生化试验结果显示，侧金花盏醇、山梨醇、半乳糖酸盐、七叶苷、阿拉伯糖、枸橼酸盐、棉子糖、木糖分解为阳性；硫化氢、葡萄糖酸盐、葡萄糖为阴性。

2.3 病原菌的PCR鉴定 将提取的菌体DNA做PCR扩增，将扩增的产物均经过琼脂糖凝胶电泳检测。菌株扩增出来的片段大小约750 bp。测序之后经过BLAST分析测序与GenBank上的已知序列进行同源性比较，结果表明，分离细菌16S rDNA基因部分序列与克雷伯菌的同源性最高，达到99%。

2.4 药敏试验结果 7株分离菌的药敏试验结果统计如表1。

表1 肺炎克雷伯菌的药物敏感性检查结果

肺炎克雷伯菌对多数β-内酰胺类药物不敏感，但对于头孢菌素保持较好的敏感性，耐药性为25%。

2.5 分离菌对小鼠的致病性观察结果 试验组小鼠在接种细菌后，均表现精神沉郁、少饮少食、成群聚集在一起、出现腹式呼吸现象。感染12 h后开始出现死亡，各试验组小鼠死亡情况统计见表2。

对照组小鼠精神状态和食欲正常，被毛整洁，好动。

表2 肺炎克雷伯菌的试验感染小鼠死亡统计结果

3 讨论

自湖北和广西贵港两地肉鸭养殖场的病鸭和病鹅的肺和肝脏中分离出7株细菌，经形态学特征、培养特性、生化试验及细菌16S RNA的检查分析，鉴定该7株细菌为肺炎克雷伯菌，该菌的各种生物学特征与文献报道一致[5-6]。

将分离的7株细菌经腹腔注射途径分别感染小鼠，感染试验结果显示，7菌株感染小鼠在感染后24～36 h出现死亡，表明这些自肉鸭和鹅的体内分离的肺炎克雷伯菌对小鼠具有较强的致病性，鸭和鹅可能是携带者。肺炎克雷伯菌在水、土壤、农产品和林产品中也广泛存在，另外在海水鱼、淡水鱼等水产品中也检测到肺炎克雷伯菌[7-8]，也是人医医院内感染的常见细菌性病原[9]。提示大家应加强环境卫生的管理，尽可能通过生物安全防控措施，减少和避免肺炎克雷伯菌引起感染和传播。

因为克雷伯菌是一个条件致病菌，绝大多数动物都是携带者，如果免疫力低下，就可能会引起克雷伯菌乘虚而入引起感染。从本试验药敏结果可以看出，分离出的肺炎克雷伯菌的耐药性也比较严重，一旦发病，用药物控制难度较大，所以加强饲养管理，提高动物机体自身的抵抗力是控制和阻断该病传播的关键。