宠物犬源致病性大肠杆菌鉴定血清型检测与耐药性分析

吴萍萍

(池州职业技术学院 ， 安徽池州247000)

随着人们生活质量的提高，城市及农村宠物犬的养殖数量越来越多，宠物犬成为人们日常生活中重要伴侣动物，宠物犬的健康受到人们的关注。宠物犬的腹泻为临床中常见的疾病之一，引起宠物犬腹泻的病原主要有致病性大肠杆菌、沙门菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌等，其中，致病性大肠杆菌是引起宠物犬腹泻为临床中常见的疾病。宠物犬大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起初生幼犬急性肠道传染性疾病，初生幼犬主要表现腹泻败血症症状，成年犬感染致病性大肠杆菌后可引起泌尿系统感染、子宫炎和睾丸炎，还可以导致公犬的精子数量下降，致病性大肠杆菌严重危害宠物犬的健康[1-2]。大肠杆菌广泛存在环境中，是一种重要的人兽共患病原菌，且该菌血清型众多，许多动物具有相同的血清型，但不同地区流行的血清型不同[3-4]。在宠物犬源大肠杆菌病治疗过程中，由于不合理使用抗生素，宠物犬源大肠杆菌对抗生素也产生很强的耐药性，应引起重视[6]。

本试验从安徽池州地区宠物医院中，无菌采集腹泻宠物犬肛拭子和粪便样品63份分离得到了30株大肠杆菌。对分离的30株大肠杆菌的致病性、血清型及耐药性进行了检测分析，为该地区的宠物犬源致病性大肠杆菌病的防治提供一定的指导意义。

1 材料

1.1 病料来源 从安徽池州地区26家宠物医院中，采集腹泻宠物犬肛拭子和粪便样品63份，无菌采肛拭子和粪便，装入含灭菌PBS试管标记。

1.2 主要试剂 灭菌PBS试管、7%动物血培养基、营养肉汤培养基、伊红美蓝培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；ID32E肠道菌鉴定试剂条(法国梅里埃公司)；E.coli标准O型血清因子、0.5%石炭酸生理盐水，购自中国兽医药品监察所；常规的试剂和仪器均由本实验室提供。

1.3 实验动物 体重22 g左右健康昆明系小鼠155只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1 细菌的分离鉴定 对无菌采集的肛拭子和粪便混匀，接种7%动物血培养基上，置37 ℃恒温箱培养12～18 h，选取单个优势菌落接种于伊红美蓝培养基上，37 ℃恒温箱培养12 h。挑取伊红美蓝培养基上优势单个菌落接种于营养肉汤中纯化培养，置37 ℃摇床震荡培养12 h，对纯化培养的分离菌株进行革兰染色显微镜下观察其形态学。

2.2 细菌的生化试验 取纯化培养的分离菌株，按说明书要求加入ID32E肠道菌鉴定试条中，置37 ℃培养24 h，用ATB自动生化鉴定系统进行生化试验特性鉴定。大肠杆菌的生化特性试验判定标准(见表1)。

2.3 分离菌株的致病性试验 参考文献[5]，将体重22 g左右健康昆明系小鼠155只分成31组，每组5只，每1株大肠杆菌分离菌株通过灌胃方式攻毒1组小鼠，灌胃的剂量为 0.5 mL(108CFU/mL)/只，对照组给予等量的灭菌的生理盐水。各个试验组攻毒12 h后并观察7 d，记录发病及死亡情况，并对于死亡的小鼠进行细菌分离鉴定。

2.4 分离株血清型鉴定 参考文献[6]，采用玻片凝集试验鉴定致病性大肠杆菌的血清型，取20株致病性大肠杆菌液接种于营养肉汤中，置37 ℃摇床震荡培养12 h后，经过121 ℃高压灭菌2 h，破坏致病性大肠杆菌K抗原。冷却后用标准血清单因子进行玻板凝集反应，同时以O抗原与5 g/L石炭酸生理盐水作为对照。

表1 大肠杆菌生化特性试验判定标准

+：阳性；-：阴性

2.5 分离菌株的药敏试验 按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行操作、结果判断。

3 结果

3.1 细菌的分离鉴定结果 无菌采集腹泻宠物犬肛拭子和粪便样品63份，30株分离菌株7%动物血培养基上长出具有白色、湿润、边缘光滑整齐的圆型的菌落；在伊红美蓝培养基上长出深紫黑色或者褐色、带金属光泽、大小一致的圆形菌落；革兰染色镜检，分离菌株为阴性、两端钝圆的杆状菌。与《伯杰氏细菌鉴定手册》报道的大肠杆菌培养特性和形态学一致。

3.2 分离株生化试验鉴定结果 大肠杆菌生化特性30株分离菌株均发酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，能产酸不产气，V-P试验为阴性、吲哚试验为阳性。用ID32E肠道菌鉴定试剂条和ATB全自动生化鉴定系统检测分析(表1)，结果显示，30株分离菌株与大肠杆菌评定结果合格率为99.9%～100.0%。与《伯杰氏细菌鉴定手册》报道大肠杆菌生化特性一致。

3.3 致病性试验 第1～30组小鼠在攻毒后的24～72 h，出现了食欲减退、消瘦，扎堆，腹泻，发病率为100%；通过致病试验分析，20株大肠杆菌分离株能使小鼠致死，剖检死亡小鼠，从小鼠肝脏中分离到大肠杆菌。其中，对照组5只小鼠未出现明显的变化，因而证实了20株大肠杆菌分离株为致病菌株。

3.4 分离菌株血清型鉴定结果 由表2可知，20株致病性大肠杆菌分离株中，定型的大肠杆菌为18株，定型大肠杆菌菌株为90%，2株未鉴定出血清型。18株致病性大肠杆菌分离株8种不同的血清型，以O8和O13为该地区流行的优势血清型，分别占分离株的25%、20%。

表2 致病性大肠杆菌分离株血清型鉴定结果

3.5 分离株耐药性分析结果 20株致病性大肠杆菌分离株药敏试验结果由表3可知，20株致病性大肠杆菌分离株均对头孢克肟、头孢曲松、恩诺沙星、丁胺卡那霉素4种药物高度敏感；敏感性在50%～80%；其中，对氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶、新霉素、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、多黏菌素7种药物的耐药率50%～90%之间；其他的药物耐药率在5%～20%之间。

表3 20株E.coli 分离株对18种耐药性分析结果(n=20)

4 讨论

宠物犬大肠杆菌病引起初生幼犬急性肠道传染病，临床以腹泻和败血症为主要症状，严重危害着宠物的健康[1-2]。本试验从安徽池州地区26家宠物医院中，采集腹泻宠物犬肛拭子和粪便样品63份分离得到了30株大肠杆菌。其中，通过动物致病性试验结果表明，20株大肠杆菌为致病性大肠杆菌，说明该地区宠物犬感染致病性大肠杆菌比较严重。大肠杆菌是一种广泛存在环境中的条件致病菌，可以通过多种途径感染宿主，主要以呼吸道和消化道为主[6]。尤其是刚出生的宠物幼犬免疫系统不健全，免疫力较低易感染大肠杆菌，在宠物幼犬养殖过程中应注意周围环境卫生，定期消毒，减少环境中大肠杆菌感染宠物幼犬。大肠杆菌血清型众多，不同地区流行血清型情况不同，其致病性也不同。本试验对分离的20株致病性大肠杆菌进行血清型检测，以O8和O13为优势血清型。张美君等[7]报道了从广州市5家宠物医院病犬、猫直肠拭子样品中分离177株大肠杆，其中以O1、O2和 O8为主要的流行血清型。文英[8]报道了从西宁市宠物医院中分离到了宠物犬源大肠杆菌80株，以O157、O24、O10、O644种血清型为流行的优势血清型。因而，证实了宠物犬源致病性大肠杆菌的血清型具有一定区域流行性。

宠物犬源大肠杆菌病在临床治疗中耐药的问题报道越来越多，尤其是氟苯尼考药物耐药严重[7]。20株致病性大肠杆菌分离株均对头孢克肟、头孢曲松、恩诺沙星、丁胺卡那霉素4种药物高度敏感；对氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶、新霉素7种药物产生很强的耐药性。当宠物犬感染致病性大肠杆菌时，应通过药敏试验结果，选择敏感的药物进行治疗，才能取得良好的治疗效果。