无乳链球菌耐药性及耐药基因检测

路 璐 ， 祝 宇 ， 颜兴琼 ， 龚 蕾 ， 孙卫星 ， 杨金朋 ， 曲伟杰

(云南农业大学动物医学院 ， 云南昆明650201)

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)，又称B群链球菌，它是一种具有高度传染性的专性乳腺寄生菌。在我国，因无乳链球菌引起的奶牛乳房炎发病率高达20%～40%，在德国[1]和巴西[2]等地也可达到11%～60%。可见，无乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，应引起科研人员的高度重视。

近年來，国内外的研究均表明，抗生素在临床上的广泛使用导致致病菌的耐药性问题越来越严重，尤其是多重耐药现象的产生给奶牛乳房炎的临床治疗带来了很大困难。因此，及时准确的掌握致病菌的耐药情况是目前防治奶牛乳房炎的关键，这对于指导临床合理使用抗生素、防治无乳链球菌性乳房炎有着极其重要的意义。本试验对15株无乳链球菌临床分离株进行药敏试验，并检测其携带的主要耐药基因，旨在了解本地区的无乳链球菌的耐药情况，为指导临床合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 采自昆明某地区的71份隐性乳房炎(经兰州乳房炎检测法LMT检测体细胞数>50万/mL)病牛乳样。

1.2 质控菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC25923，由云南农业大学动物科学技术学院实验室冻存；GBS标准株，购自广东微生物菌种保藏中心。

1.3 培养基和主要试剂 5%绵羊鲜血琼脂培养基；革兰染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；链球菌属生化编码鉴定管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和Gold view核酸染料，购自天根生化科技(北京)有限公司；2×RapidTaqMaster Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖，购自北京沃比森科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，购自TaKaRa(大连)公司。

1.4 主要仪器设备 所用仪器包括超净工作台、生化培养箱、气浴恒温振荡器、微量移液器、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪等。

1.5 病原菌的分离培养及鉴定

1.5.1 菌株的分离及生化鉴定 用无菌棉拭子轻轻蘸取采集的乳样在5%绵羊鲜血琼脂培养基上划线，于37 ℃ 恒温培养24 h，观察菌落形态，并挑取疑似菌落进行纯培养。于血平板上挑取疑似菌落进行涂片、革兰染色、镜检，观察其菌体形态。挑取革兰染色阳性的疑似链球菌的菌落接种血平板进行纯培养后进行触酶试验、CAMP检测和生化鉴定。

1.5.2 分子生物学鉴定 参考GenBank公布的无乳链球菌菌16S rDNA和特异性cfb基因序列，用Primer 5.0设计引物，采用PCR扩增法对疑似菌株进行鉴定，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息见表1。PCR 阳性产物直接送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.6 药敏试验 采用世界卫生组织(WHO)推荐的纸片扩散法Kirby-Bauer(K-B)，测定无乳链球菌对抗菌药物的敏感性。取细菌纯培养菌液0.2 mL滴入LB琼脂培养基中，用三角环均涂匀后用灭菌镊子将药敏纸片均匀贴于培养基表面，每个培养皿贴5片，轻压使其与琼脂表面完全接触；将培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h，用尺子测量每个药敏纸片的抑菌直径，记录重复3次，抑菌圈直径为3次重复试验结果的平均值。参照美国临床实验室标准委员会(Nccls)规定的标准进行判定。

1.7 青霉素及红霉素耐药基因的检测 通过药敏试验可知分离菌对青霉素及红霉素高度耐药，因此，通过GenBank和相关文献资料[3-4]査阅无乳链球菌青霉素及红霉素相关的耐药基因序列，运用Primer 5.0设计引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用PCR法扩增β-内酰胺类耐药基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大环内酯类耐药基因ermA、ermB、mefA，PCR产物纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。各耐药基因的引物信息见表1。

表1 引物信息

2 结果与分析

2.1 无乳链球菌的分离与鉴定

2.1.1 细菌的形态及染色特性 在5%血平板上可见到菌落呈灰白色、半透明、表面光滑、圆形隆起的小菌落，呈β溶血；挑取疑似单菌落涂片镜检，结果显示为革兰阳性菌，呈链状排列；触酶试验为阴性。将镜检形态均符合链球菌特性，且触酶试验为阴性的细菌，判定为链球菌属细菌。本试验从71份隐性乳房炎乳样中分离到链球菌36株。

2.1.2 CAMP及生化试验结果 CAMP检测可观察到部分血平板上金黄色葡萄球菌和分离菌划线交界处出现箭头样的β溶血区，结果显示呈阳性。

链球菌分离株的3次生化试验结果比较稳定，其结果显示，有部分分离株均能发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、蕈糖，马尿酸钠阳性，七叶苷、甘露醇、山梨醇呈阴性，水解精氨酸呈阳性，V-P试验阳性，PYR试验阴性。与《伯杰氏细菌鉴定手册》相对照，鉴定出无乳链球菌15株，所占比例为41.7%。

2.1.3 PCR鉴定结果 对临床分离的36株疑似链球菌进行PCR鉴定，结果显示，有15株分离菌通用引物PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像系统可看到在1 500 bp处出现明亮的条带；其特异性引物则在903 bp处出现明亮的条带，两种引物均与预期条带一致(图1、2)。在NCBI网站上进行BLAST程序比对分析，结果显示与无乳链球菌的同源性均在99%以上。该结果与上述生化鉴定结果一致。

图1 15株无乳链球菌通用引物PCR产物电泳图

M：DL-2 000 Marker；W：阳性对照； 1～15：PCR产物； 16：阴性对照

图2 15株无乳链球菌特异性引物PCR产物电泳图

M：DL-2 000 Marker；W：阳性对照； 1-15：PCR产物； 16：阴性对照

2.2 药敏试验结果 分别对15株奶牛乳房炎源无乳链球菌临床分离株进行药敏试验，结果表现出不同程度的耐药性。该试验结果表明，本试验无乳链球菌对目前临床上使用的大部分抗生素比较敏感，如对头孢类抗生素、四环素类、喹诺酮类及庆大霉素、卡那霉素、复方新诺敏中度或高度敏感，可供临床参考；但也有部分菌株对一些药物产生了不同程度的耐药性，如对青霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、万古霉素、氨苄西林、新生霉素、磺胺异恶唑的耐药率均较高，耐药率依次分别为100%、93.3%、93.3%、93.3%、93.3%、80%、80%、53.3%，尤其是对青霉素严重耐药，其耐药率达到100%。药敏试验结果见表2。

15株无乳链球菌分离株，表现出不同的耐药类型，其中最少的是3耐(1株)，最多可达到15耐(1株)。大部分菌株表现出7种或8种耐药表型，其中7耐有5株，占33.3%；8耐有4株，占26.7%。在分离的15株无乳链球菌中，共出现10种耐药谱。该结果表明，奶牛场长期频繁大量使用青霉素、红霉素等药物，并且不按照相关用药规定使用，滥用抗生素，导致如此高的多重耐药现象的产生，这种现象应引起高度的重视。15株无乳链球菌分离株的相关耐药谱及耐药类型见表3。

2.3 耐药基因检测结果 采用PCR法对β-内酰胺类耐药基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大环内酯类耐药基因ermA、ermB、mefA进行了检测，并将测序结果在NCBI上进行了BLAST比对，试验结果显示在β-内酰胺类耐药基因检测中，15株无乳链球菌均检出pbp1a和pbp2b基因，其检出率均达到100%，但未检出pbp2x；在大环内酯类耐药基因检测中，ermB的检出率达到100%，15株均含有ermB基因，ermA和mefA基因均未检出。耐药基因检测结果见图3、4、5。

表2 15株无乳链球菌分离株药敏试验结果

注：S：敏感，I:中介R：耐药

表3 15株无乳链球菌分离株耐药类型和耐药谱

图3 15株无乳链球菌pbp1a基因的PCR检测结果

M:DL-2 000 Marker；P:阳性对照； 1～15：PCR产物； 16：阴性对照

图4 15株无乳链球菌pbp2b基因的PCR检测结果

图5 15株无乳链球菌ermB基因的PCR检测结果

M:DL-2 000 Marker；P:阳性对照； 1～15：PCR产物； 16：阴性对照

3 讨论

无乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，近年来，由于奶牛乳房炎的感染增多，临床上常选择性应用青霉素等抗生素成为奶牛养殖场常用的防治措施之一[5-7]，加之抗菌药的不合理使用，使得细菌的耐药性增加，常用抗菌药物(β-内酰胺类)的杀菌作用大大减弱。本次试验通过对分离的15株无乳链球菌耐药性检测结果可知本地区无乳链球菌分离株对常用的青霉素类、红霉素、林可胺类等抗生素存在不同程度的耐药现象，尤其对青霉素完全耐药，故临床上不能继续使用此类药物来治疗乳房炎，应选择敏感性高的药物，如头孢类、喹诺酮类等抗生素控制乳房炎。此外，该地区的多重耐药现象也比较严重，其中以7耐和8耐居多，共9株，占60%，这很可能是本地区奶牛乳房炎的治疗失败原因之一。因此，在治疗奶牛乳房炎时应合理使用抗生素，定期进行耐药性检测，及时调整药物使用方案。

本试验通过对耐青霉素和红霉素的分离菌进行常见耐药基因的检测结果显示，15株无乳链球菌均检出携带ermB、pbp1a和pbp2b基因，说明在本地区导致无乳链球菌红霉素耐药的主要机制是ermB基因，而pbp1a和pbp2b基因是导致该菌青霉素耐药的主要机制。本次试验结果分析可知，耐药性菌株携带erm和pbp基因，其中所有分离菌均含有pbp1a和pbp2b两种耐药基因，与药敏试验结果一致，均表现出青霉素耐药，而大部分携带ermB基因的菌株与药敏试验结果相符，表现出红霉素耐药，但有1株菌携带ermB基因却不对红霉素耐药，这很可能是由于该株菌基因不表达或其表达量较低引起的。由于青霉素和红霉素均存在多种耐药基因，且各地区基因的分布情况差异较大，为了完全弄清楚该地区奶牛乳房炎无乳链球菌耐药基因分布情况，还需要进一步对其进行更广泛更深入的探究。