猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

黄超华 ， 张全红 ， 曹琛福 ， 王 潇 ， 林彦星 ， 史卫军 ， 花群义

(1.深圳出入境检验检疫局 动植物检验检疫技术中心 ， 广东深圳518045 ； 2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心 ， 北京昌平100096)

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，分为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)以及2016年新发现的猪圆环病毒3型(PCV3)[1]。其中，猪圆环病毒2型呈世界流行性，在我国猪群中也有较高的感染率[2]，对我国乃至世界养猪业影响巨大。猪圆环病毒2型是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)以及猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)如猪皮炎和肾病综合征、PCV2相关性肺炎、繁殖障碍和肠炎等的主要致病因子[6]。同时，PCV2经常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)等形成混合感染，相互增强毒力，造成感染猪群免疫抑制，使感染猪场的防控与防治更加复杂与困难，从而严重影响养猪场的生产效益[3]。

目前国内外研究人员已建立了多种PCV2的检测方法，如病毒分离、常规PCR、实时荧光PCR、环介导恒温扩增(LAMP)以及间接免疫荧光(IFA)等检测技术[9]。而本试验所使用的重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是英国公司TwistDxInc于2006年研发的一种核酸恒温扩增技术，能够在15～20 min内进行常温下(37 ℃～42 ℃)的核酸检测。该方法扩增效率极高，反应体系中的重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，与核酸模板上的同源序列结合，同时在单链DNA结合蛋白(SSB)协助下，DNA聚合酶引导产生解链和DNA合成，最终形成新的DNA双链，从而实现高效扩增[4-5]。RPA扩增的速度非常快，灵敏度高，对硬件设备要求低，而且不需要复杂的样本处理。与其他核酸恒温扩增技术相比，RPA 技术不需热变性，因此反应时间更短，可以多通道同时检测多个靶基因，而且有多种方法可用来检测扩增产物，其中实时荧光RPA通过与荧光探针结合实现对DNA扩增情况进行实时监测。因此，RPA技术有更广阔的应用价值，其中，RPA 技术在病原学检测领域的研究尤为热门，至今已经建立了针对细菌、病毒、寄生虫等多种病原体的RPA 检测方法[7-12]。本试验选取PCV2cap基因保守序列为靶基因，设计并筛选出一组引物探针组合，成功建立了一种用于检测猪圆环病毒2型的重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法，并进行了初步应用。

1 材料与方法

1.1 材料 病毒：猪圆环病毒2型(PCV 2)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)弱毒疫苗均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保存。临床样品：采自猪场或送检的猪血液、淋巴结、脾、肺、肾组织等临床样品共183份。细胞：PK15细胞、Marc145细胞由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心传代和保存。主要试剂和仪器：病毒核酸抽提试剂盒及全自动磁珠提取纯化系统，美国Thermo公司产品；超微量核酸蛋白浓度分析仪，英国BioDrop公司产品；TwistAmp®exo kit，英国TwistDx公司产品；等温扩增仪T16-ISO，澳大利亚Axxin公司产品；7500实时荧光PCR仪，美国ABI公司产品。引物与探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 引物和探针的设计 根据英国TwistDx公司RPA引物和探针设计原则，本研究参考NCBI GenBank中公布的PCV2病毒的cap基因序列，通过比对cap基因中的保守序列，设计出多条特异性引物和探针，通过交叉试验筛选一对最佳的引物和探针组合。

1.3 病毒核酸的提取 采用Thermo病毒核酸抽提试剂盒在全自动磁珠提取纯化系统上提取病毒核酸。阳性对照样品，先制备PK15细胞和Marc145单层细胞，将PCV 2、PCV1、PRV、PPV接种于PK15细胞，PRRSV接种于Marc145细胞，每日观察细胞病变，待细胞病变达75%时，收获病毒培养液，提取病毒核酸。具体操作方法参照核酸抽提试剂盒和全自动磁珠提取纯化系统说明书进行，并用Biodrop超微量核酸蛋白浓度分析仪测定提取的病毒核酸浓度。

1.4 RPA反应体系与条件 根据TwistAmp®exo kit试剂盒提供的反应指引进行操作，反应总体系为50 μL，向含有冻干RPA酶粉的反应管中依次加入Rehydration Buffer 29.5 μL、上、下游引物(浓度为10mol/L)各2.1 μL、RPA探针(浓度为10 μmol/L)0.6 μL、样品DNA 2 μL和DEPC水11.2 μL，充分混匀后再加入2.5 μL MgAc溶液。快速离心混匀后迅速将反应管置于等温扩增仪中，40 ℃反应5 min，取出离心混合再继续反应15 min，反应过程中实时监测FAM荧光信号。

1.5 特异性试验 为验证建立的RPA方法的特异性，本试验提取了几种具有相似临床症状的猪病病毒核酸，包括PCV1、PRV、PPV、CSFV、PRRSV等，以这些核酸为模板进行RPA反应，同时设置PCV2核酸为阳性对照，正常健康猪核酸为阴性对照。所有核酸的浓度均为0.5 ng /μL。

1.6 灵敏性和重复性试验 将提取的PCV2 核酸进行10倍比稀释，各取2 μL为模板进行反应测定RPA方法的敏感性。同时用猪圆环病毒II型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行比对，反应体系为25 μL；核酸扩增反应液15 μL、猪圆环病毒2型反应液2 μL、PCR酶混液2 μL、核酸模板 5 μL；反应条件：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 5 s，退火/延伸55 ℃ 40 s，40个循环。另外，每一个浓度分别用RPA方法重复检测6次，分析其检测稳定性。

1.7 临床样品检测 将所采集淋巴结、脾、肺、肾等组织样品，用PBS稀释并研磨成匀浆，反复冻融3次后，加入蛋白酶K和SDS进行消化，4 500 r/min离心15 min，取上清液按照1.3方法提取病毒核酸；所收集的猪血液直接加入蛋白酶K和SDS进行消化后，4 500 r/min离心15 min，取上清液按照1.3方法提取核酸。并用本试验建立的RPA恒温扩增方法和国家标准《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》(GB/T 35901-2018)分别对本实验室收集的183份临床样品核酸进行检测，比较两者的符合性。

2 结果与分析

2.1 引物和探针 将设计合成好的多条上下游引物和探针进行交叉组合，按照RPA反应体系和条件进行RPA反应，最终筛选出1对最佳的上下游引物和探针组合(表1)。

表1实时荧光RPA方法最佳引物及探针核苷酸序列

名称序列(5'-3')PCV-FCTACATTTCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCCPCV-RCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCPCV-PTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTA-ATCAATAGTGGAATCTAGGAC

注：PCV-P探针修饰如下：(1)第31个碱基修饰BHQ1-dT；(2)第35个碱基修饰6-FAM-dT； (3)第33个碱基替换为dSpacer; (4)3'端修饰C3 Spacer

2.2 特异性分析 用PCV1、PRV、PPV、CSFV、PRRSV核酸等为模板，对本试验建立的RPA方法的特异性进行分析。结果显示，PCV2 核酸为阳性对照出现明显的扩增曲线，其他相关猪病病毒核酸和阴性对照以及空白对照均未出现扩增曲线，显示为阴性，表明本试验建立的PCV2 检测方法能快速检测出PCV2核酸，且特异性强，与其他病原体无交叉反应(见中插彩版图1)。

2.3 灵敏性和重复性分析 提取并测定的PCV2核酸浓度为0.87 ng /μL，将其进行10倍比系列稀释，分别用本试验建立的RPA方法和商品化的PCV2实时荧光PCR试剂盒进行灵敏性试验。结果显示，本试验建立的RPA方法可检测出病毒核酸的最大稀释倍数为10，对应的核酸浓度为0.87×10-4ng / μL；而根据试剂盒中阴阳性判定标准：当CT<35，并出现标准“S”曲线时判为阳性，当CT≥35时判为阴性，实时荧光PCR试剂盒可检测出PCV2病毒核酸的最大稀释倍数为104，对应的核酸浓度为0.87×10-4ng /μL，见中插版图2、3。由此可见，本试验建立的PCV2病毒核酸RPA检测方法的灵敏度与商品化的PCV2实时荧光PCR试剂盒相当。

另外，用建立的RPA方法重复检测倍比稀释后的病毒核酸6次，重复检测结果一致，可检测病毒核酸的最高稀释倍数均为104，说明所建立的PCV2病毒核酸实时荧光RPA检测方法重复性良好。

3 临床样品检测

提取本实验室收集的183份临床样品核酸，分别用本研究建立的实时荧光RPA方法和国家标准《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》(GB/T 35901-2018)进行检测。结果表明，两种方法的符合率为98.9%。

4 讨论

PCV2的感染造成猪群免疫力下降，进而导致其他多种病原(PRV、PRRSV等)混合感染，生产机能下降，给养猪业造成严重的经济损失。而且，近几年的调查发现，PCV2 阳性率有逐年增长的趋势[13]。目前，国内外主要以荧光PCR技术作为实验室的PCV2快速核酸检测方法。荧光PCR方法具有较高的准确性和灵敏性，但其检测时间长(1 h以上)，需要大型昂贵仪器，因此不适用于基层实验室或者养猪场的PCV2现场快速筛查。RPA技术不需要繁琐的热循环，无需变性，恒温条件下10～15 min即可完成核酸扩增，而且灵敏度高，不需要复杂的样本处理，可以真正实现便携式的快速核酸检测。因此，本研究建立的PCV2实时荧光RPA技术为PCV2核酸的快速检测提供了一种新方法。

实时荧光RPA技术的关键点在于引物和探针的设计与筛选，RPA引物比一般的PCR引物长，通常需要达到30～38个碱基，同时探针也与荧光PCR的探针不尽相同，除了其两侧连接dT-荧光基团和对应的dT-淬灭基团之外，中间含有1个碱基类似物(如dSpacer)；此外，在3′端连接一个基团(如C3-spacer)以防止聚合酶延伸探针。

本试验以PCV2cap基因的保守序列为模板，设计出多条引物和探针，通过交叉试验，最终筛选出一组最佳的上下游引物和探针组合。经特异性试验证实，该实时荧光RPA方法特异性强，与其他常见的病原体无交叉反应。同时，本试验建立的RPA方法灵敏性高，最低可检出PCV2核酸浓度为0.87×10-4ng /μL，与商品化的PCV2实时荧光PCR试剂盒一致。本试验将所建立的RAP方法进行了初步应用，共检测了183份临床样品，其结果与实时荧光PCR试剂盒检测结果高度一致，两者之间的符合率为98.9%。然而相比荧光PCR反应时长1 h20 min，RPA方法反应时间大大缩短到20 min，仅前者的六分之一。同时，考虑到实时荧光PCR需要大型仪器设备等因素。因此，本研究建立的PCV2实时荧光RPA快速检测方法作为一种新方法，具有较高的推广应用价值，适用于我国基层实验室和养猪场PCV2的快速筛查，为防治乃至根除PCV2提供一定的技术支持。