沙虎鲨血常规检查方法及外周血细胞形态观察

罗 清 , 高加卿

(万达文化旅游规划研究院 ， 北京朝阳100022)

鲨鱼在分类学上属于软骨鱼纲，板鳃亚纲，侧孔总目。它们的共同特征是骨架由软骨构成，躯体呈流线型，皮肤覆有盾鳞，鳃裂每侧5～7个，牙齿数层可更换[1]。在国内，几乎所有的公共水族馆均引进鲨鱼进行展示，养殖品种主要有黑鳍鲨、白鳍鲨、柠檬鲨、沙虎鲨、护士鲨、豹纹鲨、扁鲨、双髻鲨以及鲸鲨等，但现有的医疗技术水平难以满足鲨鱼健康管理的要求，鲨鱼一旦患病，饲养管理人员往往感到无能为力。现阶段中国水族馆行业正处于发展的高峰期，目前国内开业及在建的水族馆或海洋乐园已接近200家，人工养殖各种鲨鱼的数量大大增加，临床病例也越来越多，但常常因缺乏检查手段而影响诊治。血常规检查在人类及其他许多动物的健康检查、疾病诊治过程中具有不可或缺的价值，但鲨鱼的血常规检查，目前国内尚未见报道，国外相关文献资料也非常有限。本文以沙虎鲨(Car-chariastaurus)为例，着重介绍鲨鱼血常规检查的具体操作方法和外周血细胞形态，以期为业内相关人员提供借鉴和参考，使血常规检查在鲨鱼的健康评估方面发挥应有的价值。

1 试验材料

1.1 试验动物 2条成年雌性沙虎鲨，其中1条编号CT-2，体长2.8 m，体重约160 kg；另一条编号CT-5，体长2.6 m，体重140 kg。这两条沙虎鲨人工饲养3年以上，试验前1年内活动、进食及排泄等均未见异常。

1.2 仪器及试剂 OLYMPUS CX31生物显微镜，TRIAC 420200离心机，改良Neubauer血细胞计数板，改良Natt-Herrick稀释液，Wright-Giemsa染液，Eppendorf移液器等。

2 试验方法

2.1 血液采集 鲨鱼采血方法有多种，由于本试验中的沙虎鲨体型较大，为便于操作，特选择尾部外侧动脉进行采血。采血时由4名潜水员手持自制的聚乙烯塑料袋下水捕捉沙虎鲨。待沙虎鲨钻入塑料袋后，立即卷起袋口并将其拖至水池边，然后掏出鲨鱼尾鳍，使尾部露出水面。局部消毒后用5 mL或10 mL的无菌注射器、20 G(0.9 mm)针头沿尾部侧线垂直进针采血1～2 mL，将血液注入EDTA-K2抗凝管中，混匀后及时送实验室检验。

2.2 白细胞和红细胞计数 用移液器取Natt-Herrick稀释液990 μL放入一次性塑料试管中，再加入10 μL抗凝全血，即稀释100倍。充分混匀后用移液器吸取细胞悬液，充入改良Neubauer血细胞计数板的计数池内。静置2～3 min后置于显微镜下用低倍镜或高倍镜分别计数白细胞和红细胞。白细胞计数区为四角的4个大方格，红细胞计数区为中央大方格内的四角和正中5个中方格。计数时对于压线的细胞应采用数上不数下，数左不数右的原则，以保证计数域的一致性，使计数准确。计数后通过换算分别得出白细胞、红细胞总数[2]。

2.3 红细胞比容测定 红细胞比容也称红细胞压积，测定时用毛细管吸取混匀的抗凝全血，将毛细管的一端插入胶泥中，封口，然后把毛细管放在离心机的比容槽上，以12 000 r/min离心5～10 min，最后测量毛细管中压实红细胞长度和血液总长度，计算其比值。

2.4 血红蛋白测定 取20 μL抗凝全血，加入5 mL氰化高铁血红蛋白(HiCN)转化液中，充分混匀，以3 000 r/min离心5 min，弃去沉淀，以消除细胞核的干扰。以标准液校正血红蛋白仪，然后将待检样品吸入仪器进行测定，直接读数即得血红蛋白量，单位为g/L。

2.5 白细胞分类计数 取血液1小滴置于载玻片的一端，用盖玻片推制血涂片，自然干燥后使用Wright-Giemsa染液进行染色。油镜下分类计数100个白细胞，得出各种白细胞所占百分率。

3 试验结果

3.1 血常规检查结果 两条沙虎鲨血常规检查结果见表1。

3.2 红细胞形态 沙虎鲨外周血经改良Natt-Herrick稀释液稀释后红细胞呈卵圆形，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞质不着色或染淡紫色，细胞核染紫红色(见中插彩版图1)。血涂片经Wright-Giemsa染液染色后成熟红细胞大多呈椭圆形，细胞质染淡红色，细胞核呈圆形，多居中或稍偏于一侧，染深紫红色(见中插彩版图2)。另外，在本试验中可见少量未成熟红细胞。未成熟红细胞呈圆形或椭圆形，细胞质呈现出不同程度的嗜多色性，染成蓝色或蓝灰色，在个别未成熟红细胞的细胞质内可看到Howell-Jolly体，细胞核大而居中，染深蓝紫色。

表1 沙虎鲨血常规检查结果

3.3 白细胞形态 鲨鱼外周血经改良Natt-Herrick稀释液稀释后粒细胞染黑紫色；单核细胞个体大于其他细胞，染淡紫色；淋巴细胞个体较小，染深紫色，看不到明显的细胞质(见中插彩版图1)。血涂片经Wright-Giemsa染液染色后，白细胞可明显区分为嗜中性粒细胞、异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞6种。各种正常成熟白细胞形态如下：嗜中性粒细胞呈圆形或稍不规则，细胞质是无色的，内含少量嗜中性颗粒或者无明显颗粒，细胞核多为1～2叶，染深蓝紫色；异嗜性粒细胞形状不规则，细胞质中有染成粉红色的细杆状颗粒，细胞核染紫红色，分1～4叶不等，单个未分叶核形状多不规则。嗜酸性粒细胞与异嗜性粒细胞大小相似，细胞质中充满红色圆形颗粒，细胞破碎后嗜酸性颗粒常分散在细胞核附近，细胞核一般为1～2叶，2叶居多，染蓝紫色。嗜碱性粒细胞在鲨鱼外周血中很少见[3]，笔者所见嗜碱性粒细胞呈不规则形，细胞质中含有一些大而深染的嗜碱性颗粒，细胞核未分叶。淋巴细胞按个体大小可分2～3种，反映了不同的成熟阶段[4]，小淋巴细胞呈圆形，圆形细胞核染成深蓝色，细胞质很少，通常是在核的外面显现很窄的边或锯齿状轮廓；大淋巴细胞形状不完全规则，细胞质相对较多，染淡蓝色。单核细胞多呈圆形，也有不规则形，细胞质丰富，染成淡蓝色或灰蓝色毛玻璃样，有时可见空泡，细胞核呈不规则圆形、肾形或马蹄形等，核染色质疏松染紫红色(见中插彩版图2)。

3.4 凝血细胞形态 鲨鱼外周血经改良Natt-Herrick稀释液稀释后可见凝血细胞个体较小，染色较粒细胞浅，染浅紫色。血涂片经Wright-Giemsa染液染色后，可见凝血细胞有梭形、椭圆形、圆形等多种形状，细胞核多为椭圆形或圆形，染紫红色至深紫色不等，细胞质较少，染淡紫色。圆形的凝血细胞与小淋巴细胞相似，只是核染色质相对疏松着色稍淡，细胞质着色较浅，有时含有少量嗜酸性颗粒(见中插彩版图2)。

4 讨论

为维持较高的血浆渗透压以适应海水环境，鲨鱼血液中含有高浓度的尿素、氧化三甲胺、钠离子、氯离子等[5-8]。因此，在进行红细胞和白细胞计数时，特采用改良Natt-Herrick稀释液(1 000 mL蒸馏水中加入氯化钠17.38 g，尿素31.5 g，硫酸钠2.5 g，磷酸氢二钠2.91 g，磷酸二氢钾0.25 g，甲基紫2 B 0.1 g，37%甲醛7.5 mL)[9-10]。根据健康鲨鱼外周血中的红细胞和白细胞数量，一般来说用改良Natt-Herrick稀释液将全血稀释100倍进行计数是比较合适的。若遇到红细胞或白细胞过高的样本，可增加稀释倍数；反之，若红细胞或白细胞过低可降低稀释倍数。

鲨鱼外周血细胞与禽类比较接近，红细胞、白细胞和凝血细胞均含有细胞核，使用血液分析仪通常无法准确进行血常规检查，尤其是红细胞总数、白细胞总数及白细胞分类计数结果误差较大，但血红蛋白和红细胞比容检测结果具有一定的参考价值，若实验室无血红蛋白仪和测定红细胞比容的离心机时，可尝试使用血液分析仪测定这两项指标(因受细胞核的影响，使用血液分析仪测定血红蛋白，结果通常略偏高)。由于本试验中的样本量少，也未检索到沙虎鲨血液学相关文献资料，文中血常规检查结果仅供参考。

关于鲨鱼白细胞分类计数，目前在国际上尚没有统一的命名和分类标准，如Arnold将细胞质中含有染成粉红色细杆状颗粒的白细胞判定为嗜酸性粒细胞，将凝血细胞与白细胞一起分类计数[10]。然而，细胞质中含有染成粉红色细杆状颗粒的白细胞与公认的嗜酸性粒细胞在细胞质颗粒和细胞核形状方面都存在明显差异，依据禽类的传统分类方法，笔者将其归入异嗜性粒细胞[11]。另外，考虑到检验人员的操作习惯，同时便于临床医师参考，笔者建议在涂片做白细胞分类时，勿将凝血细胞计数在内。值得一提的是，在沙虎鲨外周白细胞分类时可见少量嗜中性粒细胞，笔者以往在企鹅、海龟等动物的白细胞分类中尚未见到，而沙虎鲨的异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及凝血细胞等在形态方面与企鹅、海龟较为相似。

国际上有关鲨鱼疾病的报道越来越多，临床诊断技术较以往也有了明显的进步[12]。血常规检查是鲨鱼临床疾病诊断中重要的手段之一，血常规检查的目的是评价其健康状况，为疾病的诊断、疗效观察、预后判断提供依据，因此，了解各项指标的临床意义亦很重要。白细胞总数升高通常与感染及炎症有关，白细胞总数降低伴随淋巴细胞减少或嗜中性粒细胞升高表明应激反应或脓毒症[13-14]。异嗜性粒细胞类似于哺乳动物的嗜中性粒细胞，具有较强的噬菌功能，对机体有重要的保护作用，感染性疾病、应激等可导致异嗜性粒细胞增多。嗜酸性粒细胞也可以吞噬细菌和其他外来物质，但吞噬能力没有异嗜性粒细胞强。一般认为嗜酸性粒细胞与胃肠道、皮肤、鳃丝的抗原刺激和寄生虫感染有关[15]，但也有人认为鲨鱼嗜酸性粒细胞升高与寄生虫感染无关[16]。因此，关于鲨鱼的嗜酸性粒细胞功能，尚有待进一步研究。嗜碱性粒细胞在鲨鱼外周血中很少见，其功能尚未明确，可能如其他高等脊椎动物一样，参与过敏反应。淋巴细胞具有重要的免疫功能，某些病毒性感染症可见淋巴细胞数量上升，各种引起异嗜性粒细胞增多的原因均可导致淋巴细胞相对减少。在更高等的脊椎动物中，单核细胞可分化成巨噬细胞，不仅具有强大的吞噬功能，而且在特异性免疫中也发挥着重要作用，但在鲨鱼血液中，其功能尚不清楚，需进一步深入研究。红细胞总数、血红蛋白量、红细胞比容以及红细胞平均值测定主要用于评价鲨鱼的贫血类型或脱水，其临床意义与哺乳动物相似，不再赘述。需要注意的是，不同的盐度环境或不同的采血部位，鲨鱼的血容量会有所不同，对红细胞比容测定有一定影响，进而可影响临床判断[17-18]。另外，鲨鱼的凝血细胞相当于哺乳动物的血小板，但是凝血细胞不仅参与血液凝集，而且也具有免疫功能[19]。

本试验详细描述了沙虎鲨血常规检查的具体操作方法及其外周血中各种血细胞的典型形态，希望能为相关临床医疗人员提供参考借鉴。即使许多水族馆或海洋乐园不具备测定血红蛋白和红细胞比容的条件，仅手工进行红细胞计数、白细胞计数及白细胞分类，也能够获得重要的鲨鱼健康管理数据。因此，有必要推广鲨鱼血常规检查技术，使其作为辅助检查手段之一，在各种鲨鱼的健康检查和疾病诊断中发挥应有的作用。