贵州省PCV2流行株的分型及遗传变异分析

吴好叶 ， 徐 国 ， 梁海英 ， 曾智勇 ， 汤德元 ， 王 彬 ，黄 涛 ， 张爱琼 ， 何小莉 ， 咸 文 ， 陈 娟

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州贵阳550025 ； 2.贵州省兴义市农村工作委员会贵州兴义562400)

猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，直径约17 nm，呈二十面体对称，基因组为单股闭合环状DNA，是目前为止所发现的最小的动物病毒之一。PCV2的基因组被认为划分为11个开放阅读框(Open reading frames,ORFs)，ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒基因组正链上，ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11位于病毒基因组负链上，11个阅读框有部分互相重叠，使PCV2有限的基因组得到充分利用[1]。欧盟猪圆环病毒疾病委员组织于2008年讨论了PCV2基因分型[2]：PCV2可分为3个基因亚型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c。2009年，杨汉春等[3]对我国PCV2原有分型进行了补充：存在PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 基因型。2003年之前，PCV2a和PCV2b在欧洲和美国流行，PCV2a仅在北美洲流行[4]；2003年后，随着发病猪状况日益严重，国外PCV2的主要流行基因型也由PCV2a逐渐转变成PCV2b[5-6]；在国内许多省市也展开PCV2流行株的分型调查，结果显示，PCV2b基因型为大部分地区所流行的基因型。崔亚兰等[7]对贵州省2007-2011 年收集4 980份各地区猪血清进行PCV2抗体检测，发现阳性率为43.45%，且呈上升趋势，对PCV2病原核酸检测，阳性率高达77.44%，表明PCV2在贵州省广泛存在。综上，PCV2的感染情况变得愈加复杂多变，在全球PCV2b基因型开始逐渐取代PCV2a基因型[18]。

本研究旨在了解贵州地区PCV2的分子流行病学状况及遗传差异，将2012-2016年间所获得的16株贵州分离株PCV2基因序列与NCBI上已公布的35株参考序列进行分析研究，以期为PCV2的分子流行病学及遗传变异研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 序列来源 本研究中所分析的16株PCV2全基因序列为本课题组2012-2016年间参照文献[9]克隆测序所获得的，序列相关信息见表1。35株参考序列为在NCBI上国内外各省市检测公布的。

1.2 PCV2基因型分析 通过MEGA6.0软件构建PCV2核苷酸序列的遗传进化树，并参考2008年欧盟猪圆环病毒疾病委员会提出的PCV2基因分型的标准[2]，规定在PCV2全基因序列构建的遗传进化树上毒株间的遗传距离>0.02，或在以PCV2 ORF2序列构建的遗传进化树上两毒株间遗传距离>0.035时可将其划为不同基因型，各基因型指定相应的标准参考毒株(PCV2a AF055392、PCV2b AF055394、PCV2c EU148503、PCV2d EF524517)，对51株PCV2毒株进行分型。

表1 贵州PCV2分离株基本信息

2 结果

2.1 PCV2全基因的克隆 提取病毒液核酸以其为模板，通过PCR扩增获得PCV2全基因组，纯化回收后连至pMD19-T 载体上。抽提克隆质粒，分别进行质粒PCR鉴定和HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定。将经鉴定均为阳性的克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所测序列的GenBank Blast结果表明，序列均为PCV2全基因组序列。

2.2 PCV2基因型分析 通过MEGA 6.0软件，以51株PCV2全基因组序列为分析对象构建了PCV2核苷酸序列的遗传进化树(图1)。结果显示，本次所分析的16株PCV2序列中3株为PCV2a型，5株为PCV2b型，8株为PCV2d型；表明贵州地区的PCV2流行病毒株有逐步趋向PCV2d的流行趋势。

2.3 PCV2基因组序列分析 通过DNAStar软件的EditSeq模块对贵州地区PCV2分离株的全基因序列和ORF2序列进行分析，结果表明，贵州省PCV2流行株之间的全基因和ORF2序列大小有一定的差异，PCV2a的全基因组大小为1 768 nt，比PCV2b和PCV2d的全基因组多1个碱基，通过多重比对发现，其多出的碱基T位于PCV2a基因组正链的第1 044位，相应多出的氨基酸G位于第494位氨基酸。其次，PCV2a、PCV2b、PCV2d ORF2基因组大小分别为702 nt、702 nt、705 nt。在PCV2a、PCV2b、PCV2d这3种基因型中，同种基因型之间的PCV2全基因和ORF2所编码的氨基酸序列相似性都较高，说明PCV2的序列保守性可能与基因型相关。通过DNAStar软件的MegAlign模块分析51株PCV2毒株之间的核苷酸序列的差异，结果显示，各PCV2毒株的核苷酸序列之间的变异率各不相同，其中变异率较大的为ORF6(32.22%)、ORF10(29.63%)、ORF2(24.11%)、ORF5(21.60%)、ORF7(20.00%)，具体见下表(见表2)。

图1 PCV2核苷酸序列遗传进化树

表2 PCV2各ORFs基因序列变异情况分析

整体上，在对16株PCV2 ORF2的氨基酸序列比对中发现氨基酸差异一共有48处，其中因基因型不同而引起的差异有31处，进一步表明了PCV2同种基因型之间较为保守。在这些差异中PCV2a与PCV2b有8处相同，PCV2a与PCV2d有4处相同，PCV2b与PCV2d有17处相同(表3)。表明不同基因型的PCV2之间的氨基酸序列相似性不高，不同基因型之间包括抗原性在内的其他特性可能会有所差异。另外，对PCV2 ORF2氨基酸序列进行相似性分析发现，PCV2a之间的氨基酸序列相似性为98%～100%，PCV2b之间的氨基酸序列相似性为98.3%～99.3%，PCV2d之间的氨基酸序列相似性为98.6%～99.9%。PCV2a与PCV2b之间的氨基酸序列相似性为91.3%～92.6%，PCV2a与PCV2d之间的氨基酸序列相似性为89.2%～90.0%，PCV2b与PCV2d之间的氨基酸序列相似性为93%～94.6%。由此可见，编码PCV2的衣壳蛋白的ORF2在同种基因型之间也具有较高的保守性，而在不同基因型之间的差异性则相对较大，其中PCV2a与PCV2d的衣壳蛋白的氨基酸相似性最高仅为90%。由此推测不同基因型之间ORF2的抗原性可能存在较大的差异。PCV2b与PCV2d的衣壳蛋白氨基酸相似性明显高于PCV2a与PCV2d的相似性，同时也证实PCV2b与PCV2d具有较近的遗传进化关系。

3 讨论

PCV2引起猪的皮炎肾病综合征、肉芽肿性肠炎、断奶仔猪多系统衰竭综合征和母猪繁殖障碍等系列综合症候称圆环病毒病(PCVD)。自2000年郎洪武在我国报道有PCV2以来，我国猪群PCVD频发，且死亡率不断增加，给养猪业造成巨大经济损失。本文采用多种生物信息学软件和网络公共资源对本实验室所分离的PCV2毒株基因组进行了比较、分析和预测。本次所分析的16株PCV2序列中3株为PCV2a型，5株为PCV2b型，8株为PCV2d型，该结果表明，PCV2d已经逐渐成为贵州地区的PCV2主要流行毒株，这些毒株基因复杂多变，且与近年来PCV2d型逐渐上升的报道相吻合[10-11]。PCV2b与PCV2a和PCV2d之间的差异远小于PCV2a与PCV2d的差异，并与PCV2a和PCV2d都具有较高的相似性，结合3种基因型的流行时段分析，推测PCV2b可能是PCV2a向PCV2d演变的一个过渡基因型。

表3 贵州地区PCV2各基因型ORF2的氨基酸差异

文中贵州PCV2a、PCV2b、PCV2d基因型之间的全基因序列和ORF2序列大小有一定的区别，且各PCV2毒株的核苷酸序列之间的主要差异存在于ORF2和ORF1内。由于ORF2编码PCV2的结构蛋白，决定其抗原性，同时与病毒的致病性有关[1]，ORF6和ORF7参与病毒的复制，ORF5与病毒的致病力有关，其缺失可致病毒致病力减弱[12-13]，由此可以推测，在不同的PCV2分离株之间，PCV2的抗原性、致病力、复制能力可能都会有一定的差异，文中有因碱基突变或缺失导致编码框不编码蛋白的毒株，如第1 206位碱基突变由→A，导致ORF4不编码氨基酸的GZ-KY株,缺失ORF11的GZ-MT株、GZ-XW1株可作为基因疫苗的候选毒株进行后续研究。

本文所涉及毒株均来源于田间样本，这些样本大部分存在猪瘟病毒、繁殖与呼吸综合征病毒和胸膜肺炎放线杆菌等病原体混合感染，且患病猪表现出不同的临床症状，证实了当前猪场疾病感染己不再单一。本试验未用同一病毒液提取核酸来对PCV2基因组多次克隆分析，从而未能验证同一样本中是否存在PCV2多种基因型混合感染的情况，后续将就此继续展开研究。