低剂量三苯基锡暴露对鲤GH/IGF-I轴的毒性效应

刘 伟，钟利桥，解华晓，吴路银，姚 凡，倪朝辉

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部长江中上游渔业生态环境监测中心，武汉 430223；3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081；4.华中农业大学水产学院，武汉 430070)

三苯基锡(triphenyltin，TPT)是一类重要的环境污染物，它具有较强的防腐、杀菌和杀藻能力，被作为船舶防污漆、木材防腐剂、PVC稳定剂和农作物杀菌剂等[1]广泛应用于农业、工业和生物医学方面，其使用量呈现逐年递增趋势。全世界平均每年有300t左右含有大量有机锡防污涂料进入到海洋环境中，对海洋环境造成巨大污染。例如，韩国沿岸的表层海水中TPT的浓度为5.9 ng/L(以锡计)[2]，青岛石老人海水浴场的TPT浓度更是高达53.2 ng/L[3]。

水环境中TPT主要通过食物链的方式进入生物体内，对水生生物产生一定的毒性影响。目前，国内外有许多关于三苯基锡化合物对水生生物的毒性效应的研究。Santos等[4]报道指出TPT可导致疣荔枝螺(Thaisclavigera)的雄性个体雌性化，中国台湾的福寿螺(Pomaceacanaliculata)也存在此现象[5]。同时，TPT对鱼类也具有多种毒性效应。Hu等[6]提出TPT可能通过改变肌肉组织结构的方式影响鱼体正常发育，甚至致畸，减缓或抑制鱼体生长的猜想，来解释我国野生中华鲟畸形和数量锐减的现象。宋志慧等[7]报道指出TPT可降低斑马鱼(Zebrafish)体内的过氧化物酶活性。

除此之外，有关环境污染物对鱼类生长及GH/IGF-I轴的毒性影响的研究也有很多。例如，Fruchtman等[8]使用久效磷处理斑马鱼发现，久效磷暴露至21 dph和30 dph时，GH表达量显著性增加且GHR基因的表达受到抑制；暴露42 dph时，GH基因的表达水平降低。GH 还可促进鲤、大麻哈鱼和罗非鱼等鱼体的IGF-I基因的表达，而IGF-I以“负反馈”的形式调控GH的合成与分泌[9]。Haruhisa等[10]通过硬骨鱼类体内的IGF-I对GH调节的研究表明，IGF-I可降低虹鳟鱼体内及体外的GH分泌。

目前，有关TPT影响对鱼类GH/IGF-I轴毒性影响的研究较少。因此，本研究以鲤为研究对象，以典型的TPT化合物三苯基氯化锡(TPTCl)为唯一目标毒物进行暴露实验，从GH/IGF-I轴的角度探讨TPT影响鱼类生长的作用机理，为研究环境污染物对鱼类生长影响的研究提供有力的数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和试剂

实验试剂：96% TPTCl(aladdin 公司)；ELISA 试剂盒(MSK公司)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO)；逆转录试剂盒购自Fermentas 公司；TRIZOL Reagent(Invitrogen)。

实验仪器：电动研磨器(10D-79219,Janke & Kunkel-Str)；低温冷冻离心机(centrifuge 5415R,Eppendorf 公司)、酶标仪(SYNERGY/2,bioTek 公司)；ProFlex PCR仪及荧光定量PCR仪7500(均购自Applied Biosystems公司)；电泳仪(DYY-12,bioTek公司)。

1.2 实验用鱼

实验用鱼为鲤，购买自长江水产研究所荆州基地。严格按照鲤养殖标准操作(水温(25±1)℃)，光照周期12 h∶12 h(光∶暗)，24 h连续通气，养殖水中溶氧充足，每d投喂商业饲料两次(8:00；14:00)，换水一次，驯养14 d后进行正式实验。

1.3 实验设计

将实验鲤平均放在12个养殖箱内(每组3个重复)，每个养殖箱放鱼18条，实验养殖水体积为100 L。依据预实验所得TPT 96 h半致死浓度和环境浓度将实验设定为0.024、0.24、2.4 μg/L三个TPT暴露组和一个对照组进行暴露实验。连续暴露7、21和48 d后分别取样，取样的前一天禁食。取样时，随机从每个实验组取6尾鱼，麻醉后抽血，低温离心(4 ℃，3 000 r/min,30 min)制备血浆，-80 ℃保存备用。取血后，取鲤肝脏、脑垂体分别置于Trizol中用于基因表达检测，均置于-80 ℃冰箱中备用；以上操作均在冰浴条件下进行。

1.4 各项指标测定及计算方法

1.4.1 血浆中GH和IGF-I 含量的测定

血浆中GH和IGF-I 含量检测按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4.2 肝脏GHR、IGF-I基因和脑垂体GH基因表达量的测定

鲤肝脏和脑垂体总RNA 的提取严格按照试剂盒说明书进行。然后荧光定量PCR仪进行q-PCR反应，反应体系(25 μL)为1μL 的cDNA、12.5 μL的 SYBR Green Mix、1 μL 的5μmol/L sense primer、1 μL 的5μmol/L anti-sense primer和9.5 μL 的ddH2O，95 ℃预变性2 min后进行35个循环，循环参数为：95 ℃ 变性15 s,60 ℃退火15 s，60 ℃延伸 1 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s后进行溶解曲线分析检测扩增产物的特异性。以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt的方法测定各基因相对表达量。各检测基因及β-actin的引物序列如表1。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers for q-PCR

1.5 数据处理方法

实验用One-Way ANOVA方差分析对数据进行统计学分析(SPSS for Win 13.0 软件)，差异显著性以P<0.05为显著性标准，以P<0.01为极显著性标准。

2 结果

2.1 TPT暴露对鲤血浆GH水平的影响

当暴露至7 d时，与对照组相比，0.24 和2.4 μg/L 暴露组血浆中GH水平随TPT暴露浓度的增加而升高且差异性极显著，0.024 μg/L暴露组无显著性变化；暴露至21和48 d时，0.24和2.4 μg/L暴露组GH含量较对照组显著降低且差异性显著，0.024 μg/L暴露组无显著差异(图1)。

图1 三苯基锡暴露对鲤血浆GH水平的影响Fig.1 Effects of plasma GH concentration on C.Carpioafter TPT exposure 数据表示为平均值±标准差(n=6)。*P<0.05，**P<0.01，图2-5同。

2.2 TPT暴露对鲤垂体GH基因表达量的影响

TPT暴露至7 d时，鲤垂体GH mRNA水平较对照组无显著性变化；暴露至21 d时，与对照组相比，2.4 μg/L暴露组垂体GH mRNA的表达被抑制且差异性极显著，其他暴露组无显著性变化；暴露至48 d时，0.024、0.24和2.4 μg/L暴露组垂体GH mRNA水平极显著性降低且呈剂量效应关系(图2)。

图2 三苯基锡暴露对鲤垂体GH基因表达量的影响Fig.2 Effects of the relative abundance on hepatic GH mRNA of C.Carpio after TPT exposure

2.3 TPT暴露对鲤血浆IGF-I 水平的影响

TPT暴露至7和21 d时，与对照组相比，0.24 μg/L暴露组鲤血浆IGF-I含量显著性降低,2.4 μg/L暴露组下降极显著，0.024 μg/L暴露组无显著性变化；暴露至48 d时，0.24 μg/L暴露组下降极显著(图3)。

图3 三苯基锡暴露对鲤血浆中IGF-I水平的影响Fig.3 Effects of plasma IGF-I concentration on C.Carpioafter TPT exposure

2.4 TPT暴露对鲤肝脏IGF-I基因表达量的影响

TPT暴露至7、21和48 d时,3个暴露组鲤肝脏IGF-I mRNA表达量随浓度的增加和时间的延长而减少，0.24 和2.4 μg/L均较对照组存在极显著差异；而0.024 μg/L暴露组仅在48 d时较对照组存在显著差异(图4)。

图4 三苯基锡暴露对鲤肝脏IGF-I mRNA表达水平的影响Fig.4 Effects of the relative abundance of hepatic IGF-I mRNA on C.Carpio after TPT exposure

2.5 TPT暴露对鲤肝脏GHR基因表达量的影响

TPT暴露鲤至7 d时，鲤肝脏GHRmRNA水平较对照组无显著差异。暴露至21 d时，与对照组相比，0.024 μg/L暴露组显著性下降，0.24 和2.4 μg/L暴露组下降极显著；暴露至48 d时，0.024 μg/L暴露组较对照组无显著差异，0.24 和2.4 μg/L暴露组下降极显著(图5)。

3 讨论

GH/IGF-I轴是硬骨鱼类生长调控的主要轴线，它可通过影响鱼体的生长、繁殖、代谢等方面调控鱼体生长[11]。GH/IGF-I轴由GH、IGF-I、GH等多种调控因子组成，其中，GH和IGF-I又是GH/IGF-I轴参与鱼类生长调控的主要调控因子[12]。正常情况下，鱼类的生长与GH含量之间存在一种正相关关系[13]。但是在环境内分泌物等外界不良因素的胁迫下，鱼体血浆GH含量和垂体GH mRNA表达量呈现先促进后抑制的趋势。郑燕[14]发现久效磷暴露罗非鱼21 d时，血浆GH含量和垂体GH mRNA表达量均有显著性增加，42 d时均显著性低于对照组。Davis等[15]对罗非鱼进行七氯暴露发现，暴露至7 d时，血浆GH含量升高，14 d后GH含量随暴露时间的增加而降低。本实验血浆GH含量测定结果与上述报道的其他内分泌物暴露对鱼类血浆GH含量及垂体GH mRNA 表达水平的结果相似。这可能是由鲤鱼肝脏中IGF-I因子对GH的合成和分泌的负反馈机制所导致。在暴露至21 d时，IGF-I对GH的负反馈作用促进了GH的分泌；但是暴露至48 d时，由于暴露时间的延长，这种负反馈调节由于逐渐适应了该种环境而减弱。

图5 三苯基锡暴露对鲤肝脏GHR mRNA表达量的影响Fig.5 Effects of the relative abundance of hepatic GHRmRNA on C.Carpio after TPT exposure

IGF-I是GH最主要也是最重要的调节基因，也是GH/IGF-I轴的核心因子[16]，它在机体的含量和鱼体的生长具有一定的相关性。研究表明，血浆中IGF-I含量及肝脏中IGF-I mRNA的表达量与鱼类的营养和生长状况具有较强的正相关性[17]。Uchida等[18]研究发现，随着罗非鱼IGF-I水平的下降，其体重和特定生长率降低。在对罗非鱼、鲑、乌颊鱼等硬骨鱼类的的研究中也得出了相同的结论[19-21]。同时，肝脏IGF-I mRNA的表达还受到垂体GH的调控[16]。研究表明，GH可以促进金鱼、鲤、罗非鱼等鱼体中IGF-I mRNA的表达[22-24]，提高血浆中IGF-I含量[25]。此外，IGF-I还以“负反馈”的形式调控GH的合成与分泌[26]。Fruchtman等[27]研究显示IGF-I能够降低虹鳟垂体GH mRNA的表达。上述研究结果与本实验结果一致，这表明TPT对肝脏中IGF-I mRNA的翻译、分泌直至运输到血浆的途径无显著影响，而可能是通过影响IGF-I基因的转录来影响IGF-I的合成，从而抑制鲤生长。其中,IGF-I对GH的“负反馈”的反馈作用也更好的解释了TPT暴露至7 d时，肝脏中IGF-I基因表达量和血浆中IGF-I水平显著性下降，而垂体中GH基因表达量和血浆中GH却显著升高这一实验结果。

GHR主要分布在肝脏，其他组织(如肾脏、鳃、肠等)也有分布但是含量很少[28]。GH主要是通过与细胞表面GH受体(GHR)结合，并促进IGF-I 的合成与分泌，由IGF-I参与调控相关蛋白与脂质的合成，进而发挥促生长作用[29]。Fukada等[30]饥饿处理鲑后发现，GH和GH mRNA水平升高的同时GHRmRNA和IGF-I mRNA 水平下降，导致鲑生长减缓。本实验中也得到类似结果，猜测可能是GHRmRNA 表达量的减少抑制了IGF-I的合成与分泌。

4 结论

(1)较高浓度的TPT(0.24 μg/L、2.4 μg/L)长期暴露时，鲤垂体 GH分泌和GH mRNA的表达均受到抑制，尤其是当TPT浓度为2.4 μg/L时，抑制效果极显著。

(2)较高浓度的TPT(0.24 μg/L、2.4 μg/L)短期暴露即可抑制IGF-I的分泌和IGF-I mRNA 的正常表达，并且随暴露时间的延长和暴露浓度的增加抑制效果越显著。

(3)短期TPT暴露对鲤GHRmRNA 的表达无显著性抑制作用，当长期暴露时，较高浓度的TPT(0.24 μg/L、2.4 μg/L)暴露均可抑制其正常表达。

以上结论显示，血浆中GH及IGF-I和肝脏中GH 基因及IGF-I 基因均可以作为环境污染物对鱼类生长影响的指示因子。