血浆miRNA-1、miRNA-21对冠心病合并糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄的影响*

关晶晶， 张 颖， 刘玉洁△

(1. 天津医科大学研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科医院心内四科， 天津 300222)

冠脉支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)患者支架植入术后中远期最主要的并发症之一，也是当前经皮冠状动脉介入治疗( percutaneous coronary intervention，PCI)领域亟待解决的问题。虽然目前大多使用药物洗脱支架(drug-eluting stent，DES)，ISR发生率较金属裸支架明显减低，但其发生率仍在5%～10%[1]。评价ISR的金标准仍然是冠状动脉造影(coronary arteriongraphy，CAG)检查，但其存在有创性及一定的并发症。因此，寻找可以预测支架植入患者预后，甚至诊断ISR的生化标志物具有重要临床意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由约22个核苷酸组成的非编码单链RNA，通过识别靶基因3’端非编码区靶位点，引起靶基因mRNA降解或抑制其翻译，进而广泛地负调控靶基因表达[2]。研究表明，miRNA在心血管细胞的生长发育、增殖迁移、损伤凋亡等过程中发挥重要作用[3]。随着胰岛素及各种降糖药的广泛应用，糖尿病(diabetes mellitus，DM)合并酮症酸中毒及感染致死率明显下降，心血管病已成为威胁DM患者生命最严重的疾病。Maeng等报道，合并DM的CHD患者PCI术后9个月支架内再狭窄率远高于非合并DM的CHD患者，同时DM组具有更多的靶血管重建[4]。Jeff等研究表明，miRNA与DM血管缺血/再灌注损伤及血管新生密切相关，在血管内皮修复中起负调节作用[5]。

近年来，大量研究表明miRNA-1、miRNA-21与心血管疾病密切相关。研究显示，miRNA-1在心肌肥大、心肌梗塞、心律失常等心脏病中发挥重要作用[6]，miRNA-21可促进损伤后新生内膜增生，减少梗死面积[7]。现阶段，miRNA-1、miRNA-21与CHD(尤其是CHD合并DM)患者PCI术后再狭窄相关性的试验研究较少见，且由于存在各类混杂因素，其结论尚不明确。本研究旨在分析对照组及CHD组患者血浆中miRNA-1、miRNA-21的含量差异，以及miRNA-1、miRNA-21对CHD合并DM患者的影响，并分析支架置入术后ISR患者与NISR患者血浆miRNA-1、miRNA-21含量的差异，进一步探讨miRNA-1、miRNA-21预测CHD患者，尤其是对CHD合并DM患者发生ISR的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

连续入选2013年12月～2015年12月来自天津市胸科医院行CAG检查的382例患者(n=382)，将其分为对照组和CHD组。对照组为可疑心绞痛行CAG检查排除CHD的患者，共195例(n=195)，根据是否患DM，又将对照组分为正常对照组(n=150)和单纯DM组(n=45)。CHD组为既往已行PCI治疗并复查CAG的患者，共187例(n=187)，根据是否合并DM，又将CHD组分为单纯CHD组(n=119)及CHD合并DM组(n=68)；根据复查CAG结果，又将CHD组(n=187)分为ISR组(n=48)及NISR组(n=139)，又根据是否合并DM，将ISR组分为单纯ISR组(n=26)及ISR合并DM组(n=22)。

诊断标准 ⑴CHD：CAG证实至少有1支冠脉分支血管直径狭窄<50%。⑵ISR[8]：CAG证实支架部位管腔狭窄≥50%(包括支架两端5 mm以内)，且排除支架内血栓和支架断裂。⑶DM：患者有糖尿病症状+随机血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(指至少空腹8 h)≥7.0 mmol/L，或葡萄糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。

纳入标准：⑴NISR组均为CAG检查证实支架内通畅患者(支架内管腔狭窄为0)；⑵入选患者植入的支架均为DES；⑶ISR组患者均为首诊、单处病变，且在PCI术后1～2年内的患者。

排除标准：⑴2处及2处以上的ISR患者；⑵急性心肌梗死合并支架内血栓或支架断裂的患者；⑶合并心脏瓣膜病、严重心力衰竭、严重心律失常、严重肝肾功能不全、严重呼吸系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病及既往接受心脏外科手术治疗的患者。

1.2 主要试剂及仪器

总RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、荧光实时定量PCR (qRT-PCR) 试剂盒、成熟miRNA序列(ID000200)、miRNA-21序列(ID000397)、miRNA-1序列(ID000416)、荧光探针及外源性cel-miRNA-39、无水乙醇、无RAN酶纯水均购自美国ABI。7500型定量PCR仪(美国ABI)、低温高速离心机(Sigma)。

1.3 研究方法

1.3.1 样本收集 入选对象均于空腹状态抽取外周静脉血4 ml，置入枸橼酸钠抗凝管中，4℃、3 000 r/min离心10 min，吸取上清液于-80℃保存。

1.3.2 样本处理 提取总RNA，反转录后运用试剂盒qRT-PCR进行定量检测，95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、60 s，40个循环，组内重复3次取平均值。miRNA表达水平以Ct值表示，采用2-△△Ct法比较miRNA的相对表达水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 CHD组miRNA-1、miRNA-21表达水平的变化

结果显示：与对照组相比，CHD组miRNA-1、miRNA-21含量均升高(P<0.05，表1)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21Control group1950.452±0.1430.469±0.213CHD group1870.507±0.177*0.509±0.165*

CHD: Coronary atherosclerotic heart disease

*P<0.05vscontrol group

2.2 CHD合并DM组miRNA-1、miRNA-21表达水平的变化

根据是否患DM，进一步细分各组(表2)。结果显示：与正常对照组相比，单纯DM组miRNA-21含量减低(P<0.05)，而miRNA-1含量无明显变化(P<0.05)；与单纯CHD组相比，CHD-DM组miRNA-1、miRNA-21含量均增加(P<0.05)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21Normal group1500.458±0.1420.513±0.203Simple-DM group450.432±0.1450.321±0.179*Simple-CHD group1190.492±0.1690.488±0.145CHD-DM group680.533±0.189#0.547±0.190#

Simple-DM: Simple diabetes mellitus; Simple-CHD: Simple coronary atherosclerotic heart disease; CHD-DM: Coronary atherosclerotic heart disease combined with diabetes mellitus

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vssimple-CHD group

2.3 ISR组与NISR组miRNA-1、miRNA-21表达水平的比较

结果显示：与NISR组相比，ISR组miRNA-1、miRNA-21含量均明显升高(P<0.05，表3)。根据是否合并DM，进一步细分ISR组。结果显示：与单纯ISR组比较，ISR-DM组miRNA-21含量明显升高(P<0.05)，而miRNA-1含量则无明显差异(P<0.05，表4)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21NISR group1390.489±0.1740.440±0.101ISR group480.559±0.178*0.711±0.148*

NISR： Non-in-stent restenosis； ISR: In-stent restenosis

*P<0.05vsNISR group

GroupnmiRNA-1miRNA-21Simple-ISR group260.544±0.1460.665±0.153ISR-DM group220.576±0.2130.768±0.119*

Simple-ISR: Simple in-stent restenosis; ISR-DM: In-stent restenosis with diabetes mellitus

*P<0.05vssimple-ISR group

2.4 CHD合并DM患者PCI术后再狭窄危险因素分析

以CHD为因变量，DM病史、miRNA-1、miRNA-21为自变量进行单因素logistic回归分析，并将有统计学意义的变量进行多因素回归分析。结果显示：DM、miRNA-1、miRNA-21是CHD的独立危险因素(OR=2.123；OR=3.066；OR=1.924，P<0.05，P<0.01，表5、6)。

以ISR为因变量，DM病史、miRNA-1、miRNA-21为自变量进行单因素logistic回归分析，并将有意义统计量进行多因素回归分析。结果显示：DM病史、miRNA-21是发生ISR的独立危险因素(OR=3.091，OR=5.654；P<0.05，P<0.01，表5、6)；同时，在CHD-DM组中，以ISR为因变量，以miRNA-1、miRNA-21为自变量进行单因素logistic回归分析，结果显示：miRNA-21是CHD合并DM患者PCI术后再狭窄的独立危险因素(OR=9.148，P<0.01，表7)。采用ROC曲线评价miRNA-1、miRNA-21对CHD患者及CHD合并DM患者发生ISR的预测价值。结果显示：miRNA-1、miRNA-21表达量对CHD患者发生ISR有较高诊断价值(AUC=0.854，95%CI为0.801-0.907；AUC=0.857，95%CI为0.768-0.947，图1A、图1B)；对于CHD合并DM患者，miRNA-21有较高诊断价值(AUC=0.783，95%CI为0.631-0.935，图2A)，而miRNA-1的诊断价值较低(AUC=0.463，95%CI为0.294-0.632，图2B)。

Tab.5Single regression analysis of CHD, ISR

IndexβWaldχ2POR95%CIDM1.02019.4600.001*2.7731.762-4.362CHDmiRNA-11.30558.1390.001*3.6892.637-5.159miRNA-210.72031.3300.001*2.0541.596-2.643DM1.39715.4620.001*4.0432.015-8.113ISRmiRNA-10.5386.4230.001*1.7131.101-4.966miRNA-211.84541.0320.001*6.3273.598-11.125

*P<0.05

Tab.6Multiple regression analysis of CHD, ISR

IndexβWaldχ2POR95%CIDM0.7534.9020.0272.1231.090-4.135CHDmiRNA-11.12033.6020.001*3.0662.099-4.478miRNA-210.6559.5620.0021.9241.271-2.914DM1.1294.6170.0323.0911.104-8.653ISRmiRNA-10.0680.2170.6411.0700.850-1.421miRNA-211.73228.6400.001*5.6542.998-10.662

*P<0.05

Tab.7Single regression analysis of ISR in CHD-DM group

IndexβWaldχ2POR95%CImiRNA-10.1707.7130.1911.1800.919-1.529miRNA-214.5169.2870.002*9.1485.010-16.703

*P<0.05

Fig.1The ROC curve of CHD group

A： miRNA-1; B： miRNA-21

Fig.2The ROC curve of CHD-DM group

A： miRNA-1; B： miRNA-21

3 讨论

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一组从内膜开始，先后在局部发生脂质与复合糖类积聚、纤维组织增生和钙质沉积形成斑块，并伴有血管壁中层退变，继发斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成的病变。Zhu等[9]研究发现，血浆中miRNA-1可作用于靶基因肌球蛋白轻链激酶(MLCK)，上调MLCK表达，促使细胞向心性收缩，增加血管内皮通透性，使炎性细胞、脂质成分等易于侵入并沉积于血管内皮内，进而发生AS。Xu等[10]将体外合成的miRNA-1导入心肌细胞，发现miRNA-1过度表达可增高心肌细胞半胱氨酸天冬氨酸酶-3(caspa细-细胞等上呈高表达，并在许多心血管疾病中呈差异性表达[11]。Jansen等[12]研究发现，缺血预适应可显著上调miRNA-21表达，并通过下调其靶基因程序性细胞死亡因子-4(programmed cell death 4，PDCD4)，抑制PDCD4下游的转录因子活化蛋白质-1(activated protein-1，AP-1)激活，对抗氧化应激损伤和细胞凋亡。本研究检测外周血血浆miRNA-1、miRNA-21含量发现，CHD组患者血浆miRNA-1、miRNA-21含量均显著高于对照组。结合上述研究，我们推测，miRNA-1表达增加可促进心肌缺血/再灌注损伤，而机体可通过增加miRNA-21表达保护缺血/再灌注损伤的心肌。

美国糖尿病学会(American Diabetes Association，ADA)和心脏病学会(American Heart Association，AHA)认为，DM是CHD的独立致病因素。Erkan等[13]采用冠状动脉Gensini评分系统评估冠脉病变的严重程度和范围，结果显示CHD合并DM患者的评分明显高于非合并DM的CHD患者，其三支冠脉分支的病变率、弥漫性病变率、病死率均高，且预后差。李雯琦等[14]发现，DM大鼠心肌组织中miRNA-1含量明显低于正常对照组，与高糖诱导心肌细胞肥大相关指标呈现同步性变化，且与ANP基因表达水平呈线性相关。刘显庆等[15]观察了在不同浓度葡萄糖中培养的血管内皮细胞miRNA-21和 PDCD4 的表达情况，发现高糖可下调血管内皮细胞中miRNA-21表达，同时增加PDCD4蛋白质表达，增加心肌或血管平滑肌细胞中氧化应激损伤和细胞凋亡。上述研究均表明，miRNA-1、miRNA-21与DM患者的心血管并发症密切相关。本研究同样发现，单纯DM组患者血浆miRNA-21含量减低，而单纯DM组与CHD-DM组miRNA-1含量无明显差异，可能与我们检测的是外周血血浆相关。

ISR的发生是个复杂的病理生理过程，确切机制尚不明确，但归纳起来主要包括内皮损伤、血栓形成、内膜增生和血管重构。基于上述miRNA-1、miRNA-21与CHD关系的研究，我们推测miRNA-1、miRNA-21在ISR中也可能起重要作用。本研究通过对ISR组与NISR组血浆miRNA-1、miRNA-21含量的比较，证实了上述推测，ISR组miRNA-1和miRNA-21含量明显高于NISR组。

miRNA-1参与ISR发生的机制可能与诱导心脏成纤维细胞向心肌样细胞转分化及作用于靶基因介导平滑肌细胞分化、增值等有关。张成等[16]发现，将miRNA-1转染到心脏成纤维细胞，心肌细胞特异性因子Gata4、Tbx5、Mef-2c表达明显增高，证实miRNA-1可诱导心脏成纤维细胞向心肌样细胞转分化。此外，miRNA-1还可通过靶基因组蛋白去乙酰化酶(HDAC4)介导平滑肌细胞(VSMC)分化及增殖[17]，而心脏成纤维细胞过度转分化及VSMC过度增殖均可引起血管壁增厚、管腔狭窄，最终导致ISR发生。但剌梅等[18]通过比较PCI术后两组患者血浆miRNA-1含量，发现：与NISR组比较，ISR组miRNA-1含量降低，与本研究结果不一致。同时，本研究中合并DM与非合并DM的ISR患者，其miRNA-1含量无明显差异，而Feng等[19]研究发现，DM动物通过抑制miRNA-1增加内皮素-1(endothelin-1，ET-1)表达，诱发心肌细胞糖超载及内皮功能紊乱，最终导致ISR发生，研究结果的差异可能与本研究ISR样本量较小有关。因此，还需要更大量样本的研究来探讨miRNA-1对CHD(尤其是CHD合并DM)患者发生ISR的作用。

本研究发现，单纯DM患者miRNA-21表达量下降，而合并DM的CHD及合并DM的ISR患者血浆miRNA-21含量增加，我们推测miRNA-21对血管内皮细胞具有双重作用，一方面，miRNA-21表达增加可通过PTEN/PI3K-AKT信号转导途径抗细胞凋亡[12]，而miRNA-21表达减低可增加PDCD4蛋白表达，增加心肌或血管平滑肌细胞中氧化应激损伤和细胞凋亡[15]；另一方面，miRNA-21通过介导内皮细胞损伤、增殖及促进VSMC增殖等机制，参与血管壁新生内膜形成，最终导致ISR。Ji等[20]的研究证实了这一点，作者发现采用球囊拉伤大鼠成熟颈动脉，损伤后再狭窄的颈动脉出现明显内膜增生，血浆miRNA-21表达明显上调；而采用基因敲除法可被动减少miRNA-21表达，损伤部位血管内膜增生状况得到明显改善。

本研究发现DM、miRNA-1、miRNA-21可作为CHD患者独立危险因素；DM、miRNA-21可作为ISR患者独立危险因素。进一步分析发现，miRNA-21是CHD合并DM患者PCI术后再狭窄的独立危险因素。ROC曲线分析结果显示，miRNA-21和miRNA-1具有较高的敏感性和特异性，检测血浆miRNA-1、miRNA-21含量对指导治疗CHD患者、预测ISR发生及观察PCI术后疗效具有重要意义，其中miRNA-21对CHD合并DM患者具有更大预测价值。

综上所述，DM、miRNA-1、miRNA-21与CHD及PCI术后再狭窄密切相关，但其作用机制还存在许多争议。本研究中，miRNA-1在CHD及PCI术后再狭窄方面的研究与既往结果有所差异，但本研究有关miRNA-21在CHD及PCI术后再狭窄方面的研究与既往的结果一致。同时本研究还发现，miRNA-21对CHD合并DM患者发生ISR具有较高的预测价值，miRNA-21可能成为CHD合并DM患者ISR诊断的新途径和治疗的新靶点。