当归与激素合用对哮喘小鼠的治疗作用及其机制*

王志旺， 付晓艳， 姚 楠， 巩子汉， 程小丽， 段海婧， 任 远

(1. 甘肃中医药大学， 兰州 730000; 2. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000)

支气管哮喘(简称哮喘)是气道慢性炎症性疾病，目前虽有抗炎平喘药、支气管扩张药等药物用于临床，但哮喘的发病率与死亡率并未随之降低[1]。糖皮质激素(简称激素)是目前治疗哮喘，特别是重症哮喘，的常用药，但用药过程中可提高血液黏稠度，缩短凝血时间。中药当归具有补血活血之功效，研究证实当归可改善血液流变学[2]；另一方面《神农本草经》谓当归“主咳逆上气”，临床上可用于治疗哮喘等呼吸系统疾病，目前研究显示当归及其挥发油对哮喘有明显的治疗作用[3]。本实验拟将当归与激素合用治疗哮喘小鼠模型，通过考察平喘指标与血液流变学指标，探讨当归与激素在治疗哮喘中的增效(平喘)减副(改善血液流变学)作用；同时，从HMGB1/TLR4/NF-κB通路来探讨当归与激素治疗哮喘的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

当归(RASI)采自甘肃省岷县，经杨扶德教授鉴定为Radix Angelicae Sinensis的干燥根，加工成饮片后用水煎煮，取滤液适当浓缩后冷藏备用；注射用氢化可的松琥珀酸钠(hydrocortisone sodium succinate, HSS)，天津生物化学制药有限公司，国药准字H12020493，批号：011606014。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、氯化乙酰胆碱(acetylcholine chloride, Ach)及磷酸组胺(histamine phosphate, Hist)，Sigma公司，批号：SLBQ8172V、BCBR3675V、BCBR3675V。氢氧化铝，天津市致远化学试剂有限公司，批号：20161003。TNF-α、IL-1β及IL-6试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20170404、20170501、20170403；TXB2试剂盒，北京北方生物技术研究所，批号：170220。HMGB1 Polyclonal antibody，ImmunoWay公司，批号：B0201；抗TLR4 antibody、抗NF-κB p65 antibody，Genetex公司，批号：821701346、41556。

1.2 仪器

鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系统(CH Technologies)，402AI型超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)，EMKA型动物肺功能检测系统(北京广源达科技发展有限公司)，LBY-N6 COMPACT全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司)，Velocity 18R型台式冷冻离心机(Dynamica公司)，CH-212型光学显微镜(Olympus公司)。

1.3 动物

SPF级BALB/c小鼠，雌雄各半，体重(16～19)g，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供并进行实验，许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.4 分组、造模并给药

将小鼠随机分为6组(n=12)，即对照(control)组、血瘀模型(blood stasis model)组、哮喘模型(asthma model)组、氢化可的松(HSS, 0.05 g/kg氢化可的松)组、当归(RASI, 8 g/kg当归)组、合用(RASI+HSS, 8 g/kg当归与0.05 g/kg氢化可的松合用)组。根据文献复制哮喘模型[4]，实验第1、8天，哮喘模型组、氢化可的松组、当归组、合用组小鼠各腹腔注射OVA致敏液0.2 ml (含100 μg OVA、2 mg氢氧化铝的生理盐水悬液)，同时背部皮下注射等量致敏液，对照组与血瘀模型组以生理盐水替代致敏。第15天开始激发，让小鼠吸入1% OVA激发液20 min，1次/d，连续7 d，对照组与血瘀模型组以生理盐水替代。从激发开始，每次激发前1 h，灌胃下述药物：当归组与合用组小鼠每天给予8 g/kg当归；血瘀模型组、氢化可的松组及合用组从激发第3天开始每次激发前1 h给予0.05 g/kg氢化可的松灌胃，1次/d，连续5 d。

1.5 肺功能测定

实验第22天测定肺功能。调试肺功能仪。将小鼠放入封闭系统中，启动系统，待小鼠安静后记录潮气量、呼吸峰与吸气峰流量等肺功能指标。

1.6 哮喘行为学实验[5]

实验第19天，按上述激发方法，让小鼠吸入Hist与Ach混合激发液(含0.2% Hist与2% Ach) 120 s，观察10 min内小鼠抓鼻次数、挠痒次数及哮喘发作症状等哮喘行为学指标。小鼠抓鼻或挠痒次数0、1～3、4～6、7次以上分别记0、1、2、3分；小鼠无哮喘症状、出现轻微哮喘症状、出现呼吸急促或呼吸频率明显加快或焦躁不安等哮喘症状、出现严重的呼吸困难等哮喘症状分别记0、3、6、9分。

1.7 采集标本、测定指标

实验第22天，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，眼眶后静脉丛采血，部分血液抗凝后测定全血黏度，部分血液凝固后分离血清测定TXB2水平。处死动物，手术暴露气管，结扎左支气管，提取支气管肺泡灌洗液(BALF)，离心后取上清液，按试剂盒说明书测定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。摘取肺脏、称重，于固定位置取左肺组织，经免疫组化染色后观测HMGB1、TLR4及NF-κB p65表达水平并进行半定量分析，另取部分左肺组织精密称重，干燥至恒重后称重，计算肺组织含水量。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 当归、氢化可的松及其合用对哮喘小鼠全血黏度及血清TXB2的影响

血瘀模型组、氢化可的松组小鼠在低切、中切与高切时的全血黏度与血清TXB2含量明显升高。与对照组比较，血瘀模型组小鼠低切、中切与高切时的全血黏度及血清TXB2含量明显升高(P<0.05,P<0.01)；与哮喘模型组比较，氢化可的松组小鼠中切与高切时的全血黏度及血清TXB2含量明显升高(P<0.05,P<0.01)，差异均有统计学意义(表1)”，但氢化可的松组低切血黏度并无差异。与氢化可的松组比较，合用组小鼠的全血黏度与血清TXB2含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，提示RASI与HSS合用治疗哮喘可明显降低全血黏度，对抗单独使用HSS治疗时提高全血黏度的作用。

Tab. 1 Effects of RASI, HSS and their combination on whole blood viscosity and TXB2 content in serum of asthmatic mice ±s, n=12)

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; TXB2: Thromboxane B2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group;△P<0.05,△△P<0.01vsHSS group

2.2 当归、氢化可的松及其合用对小鼠哮喘行为学的影响

与对照组比较，在Hist与Ach混合激发液的激发下，哮喘模型组小鼠的抓鼻次数与挠痒次数明显增多，哮喘发作程度明显加重，差异有统计学意义(表2)。与哮喘模型组比较，在当归、氢化可的松及二者合用的干预下，小鼠上述哮喘指标得到明显改善，差异有统计学意义(P<0.01)。合用组的作用有进一步增强的趋势，但与当归组、氢化可的松组比较无统计学意义。

GroupGrabing nose(times)Scratching(times)Asthma degreeControl8.92±5.702.08±2.500.75±1.36Blood stasis8.75±5.532.25±2.050.75±1.36Asthma13.83±5.31*5.17±2.79**3.25±1.54**HSS7.33±3.75##1.92±2.54##0.75±1.36##RASI8.50±3.50##2.00±2.59##1.25±1.54##RASI+HSS6.73±4.71##1.36±2.16##0.75±1.36##

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsasthma model group

2.3 当归、氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺功能的影响

与对照组比较，哮喘模型组小鼠潮气量(TV)、吸气峰流量(PIF)及呼气峰流量(PEF)显著下降，差异有统计学意义(P<0.05, 表3)。与哮喘模型组比较，在当归、氢化可的松及其合用的干预下，TV、PIF及PEF明显增加，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01, 表3)；合用组肺功能的改善作用更强，与当归组相比有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

GroupTV (ml)PIF (ml/s)PEF (ml/s)Control0.117±0.01864.28±8.46108.34±26.07Blood stasis0.115±0.01661.04±7.91103.65±25.78Asthma0.084±0.011**44.68±4.95**62.21±13.64**HSS0.105±0.015##55.67±6.03**##85.14±16.84*##RASI0.096±0.013**#49.61±5.44**#76.35±15.92**#RASI+HSS0.112±0.016##△58.59±6.75##△△92.08±18.44##△

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; TV: Tidal volume; PIF: Peak inspiratory flow; PEF: Peak expiratory flow

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group;△P<0.05,△△P<0.01vsRASI group

2.4 当归、氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺指数及肺组织含水量的影响

与对照组比较，哮喘模型组小鼠的肺指数及肺组织湿/干重比值显著升高，差异有统计学意义(P<0.01, 表4)。与哮喘模型组比较，在当归、氢化可的松及其合用的干预下，肺指数及肺湿/干重比值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；合用组肺指数及肺湿/干重比值呈现更明显的下降趋势，但与当归组、氢化可的松组比较无统计学意义。

GroupLung index (%)Wet dry weight ratio of lungControl0.665±0.1222.93±1.31Blood stasis0.651±0.1192.87±1.28Asthma0.988±0.191**5.64±1.56**HSS0.752±0.157##3.44±1.45##RASI0.796±0.179*#3.90±1.49#RASI+HSS0.725±0.133##3.07±1.40##

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group

2.5 当归、氢化可的松及其合用对哮喘小鼠BALF中细胞因子的影响

与对照组比较，哮喘模型组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6显著升高(P<0.01，表5)。与哮喘模型组比较，经当归、氢化可的松及其合用干预后，TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显下降(P<0.01)；合用组比当归组降幅更大，差异有统计学意义。

2.6 当归、氢化可的松及其合用对哮喘小鼠肺组织HMGB1/TLR4/NF-κB通路表达的影响

如图1、图2、图3所示，棕黄色为HMGB1、TLR4及NF-κB p65表达阳性细胞：HMGB1主要表达于气道上皮细胞和炎细胞的细胞核与细胞质中，TLR4主要表达于上述细胞的细胞膜与细胞质中，而NF-κB p65主要表达于上述细胞的细胞核中。对照组小鼠HMGB1、TLR4及NF-κB p65呈弱阳性表达，而在哮喘模型组小鼠表达明显增强；在当归、氢化可的松及其合用的干预下，HMGB1、TLR4及NF-κB p65的表达出现不同程度的减弱。对HMGB1、TLR4及NF-κB p65表达进行半定量分析的结果显示，哮喘模型组HMGB1、TLR4及NF-κB p65表达的平均吸光度值明显升高，与对照组比较有统计学意义(P<0.01, 图1、图2、图3、表6)。在当归、氢化可的松及其合用的干预下，HMGB1、TLR4及NF-κB p65表达的平均吸光度值下降，TLR4及NF-κB p65与哮喘模型组比较有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；合用组的下降幅度更大，与当归组、氢化可的松组比较有统计学意义(P<0.01)。

Tab. 5 Effects of RASI, HSS and their combination on cytokines in BALF of asthmatic mice (pg/ml, ±s, n=12)

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; BALF: Broncho-alveolar lavage fluid; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsasthma model group;△P<0.05,△△P<0.01vsRASI+HSS group

Fig.1Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of HMGB1 in asthmatic mice (×40)

A: Control group; B: Blood stasis model group; C: Asthma model group; D: HSS group; E: RASI group; F: RASI + HSS group

Fig.2Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of TLR4 in asthmatic mice (×40)

A: Control group; B: Blood stasis model group; C: Asthma model group; D: HSS group; E: RASI group; F: RASI + HSS group

Fig.3Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of NF-κB p65 in asthmatic mice (×40)

A: Control group; B: Blood stasis model group; C: Asthma model group; D: HSS group; E: RASI group; F: RASI + HSS group

Tab. 6 Effects of RASI, HSS and their combination on the expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB p65 in asthmatic mice ±s, n=12)

RASI: Radix Angelicae Sinensis; HSS: Hydrocortisone sodium succinate; HMGB1: High-mobility group box 1; TLR4: Toll-like receptors 4; NF-κB p65: Nuclear factor-κB p65

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma model group;△△P<0.01vsRASI+HSS group

3 讨论

当归是临床常用中药，具有“补血活血”之功效，素有“十方九归”之说。《神农本草经》开篇就说当归“主咳逆上气”，即当归可用于治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病，临床上当归与其他中药配伍成复方，如《和剂局方》中的苏子降气汤、《慎斋医书》中的百合固金汤和《医学入门》中的加味益母丸等，当归在其中发挥补血养阴润肺、活血通脉降气等功效。药理学研究显示，当归挥发油对气管平滑肌有显著的解痉作用[6]，在体研究显示当归(8 g/kg)对哮喘小鼠模型有明显的平喘作用[7]。糖皮质激素(简称激素)是目前治疗哮喘的常用药，其抗炎等作用可明显缓解哮喘的临床症状；但激素可提高血液的黏稠度，在临床上易引起不良反应，在实验中可用来复制血瘀动物模型。本次实验采用大剂量氢化可的松(0.05 g/kg)来复制血瘀动物模型，同时采用该剂量来治疗哮喘，对比观察当归、激素及其合用对哮喘的治疗作用。结果显示，当归、激素及其合用能明显降低哮喘发作程度，减少哮喘小鼠的抓鼻次数与挠痒次数，增加潮气量、吸气峰流量及呼气峰流量，改善肺功能，降低肺指数及肺组织含水量；当归与激素合用后能明显提高肺功能，作用优于RASI组，上述其他作用仅出现进一步增强的趋势。

高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种非常保守的非组核蛋白，广泛分布于机体多种组织的细胞核中，核内的HMGB1主要调控DNA的复制及RNA的转录[8]。在TNF-α、IL-1及IL-6等细胞因子的刺激下，HMGB1释放至胞外，与细胞膜Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)结合，激活核因子-κB(NF-κB)等下游信号通路，引起上述细胞因子的释放，通过正反馈机制促进炎症反应[9]。在卵白蛋白复制的哮喘小鼠模型中，TLR4被激活，而HMGB1抗体可减轻其肺组织炎症[10]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种促炎细胞因子，介导炎细胞聚集，刺激其释放大量IL-6等炎性因子，参与哮喘气道的炎症反应及其重塑[11]。白介素-6(IL-6)是一种小分子量活性多肽，在炎症反应中参与急性期反应蛋白的合成，活化T细胞以及终末分化B细胞，是气道炎症反应过程中的重要因子[12]。白介素-1(IL-1)主要由巨噬细胞产生，其中IL-1β又名淋巴细胞活化因子，可促进嗜酸性粒细胞粘附于血管内皮细胞并浸润至气道黏膜，加速其脱颗粒而诱发哮喘[13]。本实验显示，当归、激素及其合用能明显抑制HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白质的表达，降低BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的水平；当归与激素合用后对TNF-α、IL-1β、IL-6及TLR4/NF-κB的调节作用进一步增强。

糖皮质激素是目前治疗哮喘，特别是重症哮喘，的常用药，但在用药过程中可提高血液粘稠度，缩短凝血时间，对支气管哮喘、肺纤维化、肺动脉高压及肺心病患者不利[14]。血栓素A2(TXA2)是一种强烈促进血管收缩和血小板聚集的活性物质，同时TXA2也是重要的炎性介质，诱导炎细胞浸润而加重肺组织炎症反应[15]。TXA2性质不稳定，迅速转化为血栓素B2(TXB2)，TXB2可作为影响血液流变学的血小板激活指标。本实验显示，当归可缓解激素引起的TXB2活性升高、血液粘稠度增加，故可改善血液流变学的异常变化。

综上所述，当归、激素及其合用对支气管哮喘有明显的治疗作用，而抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路是其作用机制之一。此外，合用当归可明显缓解激素治疗哮喘过程中引起的血液流变学的异常变化。